Caracterização química e avaliação das propriedades
bioativas de folhas de Psydrax locuples (K. Schum.)
Bridson
Amândio David Zimba
Trabalho de Projeto apresentado à Escola Superior Agrária de
Bragança e à Faculdade de Farmácia da Universidade de
Salamanca, no àmbito do mestrado em Farmácia e Química de Produtos Naturais
Orientado por
Isabel C.F.R. Ferreira
Pablo Anselmo García García
Mª Ángeles Castro González
Bragança
2014
À Wuyane Zimba;
Ao Winly Zimba;
E a todos meus sobrinhos
Dedico.
Que sirva de fonte de inspiração para os desafios do futuro.
AGRADECIMENTOS
São devidos agradecimentos a todos aqueles que contribuíram diretamente e
indiretamente para a efetivação deste trabalho.
Aos meus orientadores, à Professora Doutora Isabel Ferreira, do Laboratório de
Química e Bioquímica Aplicada do Instituto Politécnico de Bragança (IPB)-Portugal, e ao
Professor Doutor Pablo A. García, do Departamento de Química Farmacêutica da
Universidade de Salamanca (USAL)-Espanha, pelo apoio incondicional, simpatia,
simplicidade, disponibilidade, e prontidão na orientação científica deste trabalho e sem os
quais teria sido impossível concluir o presente trabalho.
À Professora Doutora María Ángeles Castro e ao Professor Doutor José María
Miguel del Corral, ambos do Departamento de Química Farmacêutica da Universidade de
Salamanca (USAL)-Espanha, pela simpatia e amizade que sempre demonstraram durante a
realização do estágio no Laboratório de Química Farmacêutica da Universidade de
Salamanca e que muito contribuíram para tornar a minha estadia mais agradável.
Ao Professor Doutor François Munyemana, do Departamento de Química da
Universidade Eduardo Mondlane (UEM)-Moçambique, pela amizade, confiança e pela
escolha e fornecimento da amostra (material vegetal) para o estudo.
À Doutora Lillian Barros e à MSc Carla Pereira, ambas do Laboratório de Química
e Bioquímica Aplicada-IPB, pela preciosa ajuda na avaliação da atividade antioxidante dos
extratos da amostra em estudo.
Ao Doutor Ricardo C. Calhelha, do Laboratório Química e Bioquímica AplicadaIPB por toda a colaboração na avaliação da atividade antitumoral dos extratos e compostos
da amostra em estudo.
Ao Professor Doutor Carlos Aguiar, da Escola Superior Agrária (IPB), pela ajuda na
classificação botânica da amostra em estudo.
Ao corpo docente da Escola Superior Agrária de Bragança (IPB) e da Faculdade de
Farmácia (USAL) pelas teorias e modelos prestados que facilitaram grandemente na
investigação do presente trabalho.
Ao Ministério de Ciência e Tecnologia de Moçambique (MCT), pela concessão da
bolsa de estudo.
À Escola Superior de Desenvolvimento Rural (ESUDER)-UEM, pela licença
concedida para a continuação dos estudos. Ao professor Doutor Simião Balane, pelo
encorajamento na escolha do mestrado.
Ao Professor Doutor Albino Bento, pela simpatia e esforço para garantir o
transporte para o deslocamento de Bragança a Salamanca e vice-versa e à Professora
Doutora Conceição Fernandes, pela amizade, apoio moral e material durante as aulas.
Um "Kanimambo1" muito especial a toda minha família em particular aos meus
pais, irmãos e sobrinhos, pela força e encorajamento concedido durante os dois anos de
formação. À minha esposa Odete Domingos Guambe, pela compreensão, companheirismo,
paciência e incentivo permanente que muito contribuiu para a conclusão do mestrado, e aos
meus filhos Wuyane Zimba e Winly Zimba, pelo sorriso que sempre proporcionaram ao
comunicar-me com eles telefonicamente.
Ao Eng. Paulo Júlio Dimande, Luís Forquilha, Ananias Pascoal e a todos os
Angolanos da Domus Universitária, pela amizade, simpatia e momentos de lazer
proporcionados durante os dois anos de formação.
Por fim, agradeço a todos os colegas dos diversos laboratórios onde trabalhei, pela
simpatia e a colaboração dispensadas em especial à Elena V. Martin, Ángela H. García,
Ellahioui Younes, Sobinson Arsene, Tiago José e a todos os colegas do mestrado, pelo
apoio dado sempre que necessitei e pelos momentos de lazer proporcionados em
Salamanca.
A todos,
Muito obrigado!
1
Obrigado
ÍNDICE DE CONTEÚDOS
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................. iv
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... vii
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................... ix
RESUMO............................................................................................................................... x
ABSTRACT ........................................................................................................................ xii
INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
1.
ESTADO DA ARTE ..................................................................................................... 3
1.1.
Família Rubiaceae .................................................................................................... 3
1.2.
Género Psydrax ........................................................................................................ 3
1.3.
Psydrax locuples (K. Schum.) Bridson .................................................................... 4
1.3.1.
Classificação científica ..................................................................................... 4
1.3.2.
Sinonímias ........................................................................................................ 5
1.3.3.
Nomes vernaculares em Moçambique .............................................................. 5
1.3.4.
Descrição .......................................................................................................... 5
1.3.5.
Distribuição geográfica e habitat ..................................................................... 6
1.3.6.
Usos em Moçambique ...................................................................................... 6
1.4.
Composição química e propriedades bioativas de P. locuples ................................ 6
1.4.1.
Composição química ........................................................................................ 7
1.4.2.
Propriedades bioativas .................................................................................... 12
1.4.2.1.
Propriedades antiparasitárias ...................................................................... 13
1.4.2.1.1. Atividade antiplasmódica............................................................................ 13
1.4.2.1.2. Atividade antitripanossomial e antileishmanial .......................................... 14
1.4.2.1.3. Atividade nematicidal ................................................................................. 15
i
1.4.2.2.
Propriedades antibacterianas ....................................................................... 15
1.4.2.3.
Atividade antioxidante e citotóxica ............................................................ 16
2.
OBJETIVOS ................................................................................................................ 17
3.
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 18
3.1.
Material Vegetal .................................................................................................... 18
3.2.
Equipamentos e reagentes ...................................................................................... 19
3.3.
Obtenção de extratos de P. locuples ...................................................................... 21
3.3.1.
Partição do extrato metanólico ....................................................................... 24
3.3.2.
Extração ácido-base da fração metanólica solúvel em acetato de etilo
(F.MeOHsol.AcOEt) ..................................................................................................... 25
3.3.3.
3.4.
Obtenção de geninas do Ext.AcOEt ...................................................................... 36
3.6.
Ensaios de bioatividade ......................................................................................... 39
3.6.1.
Avaliação da atividade antioxidante ............................................................... 39
3.6.1.1.
Atividade captadora de radicais livres DPPH ............................................. 40
3.6.1.2.
Poder redutor ............................................................................................... 40
3.6.1.3.
Inibição da descoloração do β-caroteno...................................................... 40
3.6.2.
4.
Fracionamento e isolamento ........................................................................... 26
Avaliação do potencial antitumoral e citotoxicidade ..................................... 41
3.6.2.1.
Atividade antiproliferativa em linhas celulares tumorais humanas ............ 42
3.6.2.2.
Hepatotoxicidade em células não tumorais................................................. 43
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 44
4.1.
Extratos obtidos de folhas P. locuples e seus rendimentos.................................... 44
4.2.
Compostos isolados das folhas de P. locuples ....................................................... 44
4.2.1.
4.2.1.1.
4.2.2.
Triterpenos Pentacíclicos ................................................................................ 46
Elucidação estrutural ................................................................................... 47
Dissacáridos .................................................................................................... 52
ii
4.2.2.1.
4.2.3.
Composto 10 ................................................................................................... 65
4.2.3.1.
Elucidação estrutural ................................................................................... 65
4.2.3.2.
Análise por GC/MS .................................................................................... 66
4.2.4.
4.3.
5.
Elucidação estrutural ................................................................................... 53
Análise de geninas por GC/MS ...................................................................... 68
Bioatividade ........................................................................................................... 70
4.3.1.
Atividade antioxidante.................................................................................... 70
4.3.2.
Atividade antitumoral e citotoxicidade........................................................... 72
CONCLUSÕES ........................................................................................................... 76
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................ 78
iii
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
[α]
Rotação ótica específica
1D
Unidimensional
2D
Bidimensional
Ac
Acetato
AcOEt
Acetato de etilo
Api
Apiosa
CC
Cromatografia em coluna
DCM
Diclorometano
DEPT
Espetro de carbono 13 com seleção de carbonos (Distortionless
Enhancement by Polarization Transfer)
DMEM
Meio de cultura para células animais (Dulbecco Modified Eagle
Médium)
DMSO
Dimetilsulfóxido
DPPH
2,2-difenil-1-picril-hidrazilo
EC50
Concentração de amostra correspondente a 50% de atividade
antioxidante ou 0,5 de absorvância no ensaio do poder redutor
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
EL.
Eluição
EtOH
Etanol
Ext.MeOH
Extrato metanólico
Ext.MeOHsol.AcOEt
Extrato metanólico solúvel em acetato de etilo
Ext.MeOHsol.But
Extrato metanólico solúvel n-butanol
Ext.MeOHsol.H2O
Extrato metanólico solúvel em água
F.A.F.MeOHsol.AcOEt Fração ácida da fração metanólica solúvel em acetato de etilo
F.N.F.MeOHsol.AcOEt Fração neutra da fração metanólica solúvel em acetato de etilo
GC/MS
Cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa
GI50
Concentração da amostra responsável por 50% de inibição do
crescimento celular
Glc
Glucose
iv
COSY
COrrelation SpectroscopY
HBSS
Solução salina de Hank’s
HeLa
Linha celular humana de carcinoma cervical
HepG2
Linha celular humana de carcinoma hepatocelular
Hex.
Hexano
HMBC
Hetero-correlação 1H -13C a duas e três ligações (Heteronulear
Multiple Bond Correlation)
HMQC
Hetero-correlação com deteção de protão (Heteronuclear
Multiple Quantum Correlation)
HRMS
Espetrometria de massa de alta resolução
IV
Espetroscopia na região do infravermelho
m/z
Razão carga, massa
MCF-7
Linha celular humana de carcinoma de adenocarcinoma mamário
Me
Metil
Me2CO
Acetona
Mis.
Mistura
Mn
Mandelonitrilo
NCI-H460
Linha celular humana de carcinoma de pulmão
PLP2
Porcine liver primary cell culture
PR
Poder redutor
PTLC
Cromatografia preparativa em camada fina
Rf
Índice de retenção
RMN
Ressonância magnética nuclear
RMN 13C
1
Ressonância magnética nuclear de carbono
RMN H
Ressonância magnética nuclear de protão
ROESY
Rotating Frame Overhauser Effect SpectroscopY
RPMI
Meio de cultura para células animais
SFB
Soro fetal bovino
SRB
Sulforadamina B
TCA
Ácido tricloroacético
v
TLC
Cromatografia em camada fina
Tris
2-amino-2- (hidroximetil) propano-1,3-diol
UV/VIS
Ultravioleta visível
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Psydrax locuples (K. Schum.) Bridson .................................................................. 5
Figura 2. Compostos isolados de folhas e cascas do caule C. dicoccum. ............................. 8
Figura 3. Glucósidos cianogénicos isolados das folhas e frutos de C. huillense e C.
shimperiam. ............................................................................................................................ 8
Figura 4. Glucósidos e irdoides isolados da partes aéres de C. berberidifolium. .................. 9
Figura 5. Compostos extraídos das folhas de C. parviflorum Lam. .................................... 10
Figura 6. Compostos extraídos das folhas de C. multiflorum (Thonn.) Hier ...................... 10
Figura 7. Compostos extraídos da casca do caule de C. multiflorum (Thonn.) Hier........... 11
Figura 8. Compostos extraídos da casca do caule de C. horridum Bl. ................................ 12
Figura 9. Processo de secagem das folhas de P. locuples, ao abrigo do sol........................ 18
Figura 10. Processo de secagem rápida das folhas de P. locuples utilizando estufa. .......... 18
Figura 11. Moinho elétrico de facas utilizado para triturar as folhas de P. locuples. ......... 19
Figura 12. Folhas de P. locuples na forma fina. .................................................................. 19
Figura 13. Extração por maceração dos extratos de folhas de P. locuples. ......................... 22
Figura 14. Filtração a vácuo dos extratos de folhas de P. locuples. .................................... 22
Figura 15. Remoção dos solventes nos extratos de folhas de P. locuples. .......................... 22
Figura 16. Sequência I de obtenção de extratos das folhas de P. locuples.......................... 23
Figura 17. Sequencia II de obtenção de extratos das folhas de P. locuples. ....................... 23
Figura 18. Processo de partição do extrato metanólico. ...................................................... 24
Figura 19. Frações produzidas na partição do extrato MeOH. ............................................ 24
Figura 20. Remoção de água no extrato aquoso de P. locuples. ......................................... 25
Figura 21. Frações produzidas na extração ácido-base de F.MeOHsol.AcOEt. ................. 25
Figura 22. Realização da cromatografia em coluna de F.N.F.MeOHsol.AcOEt. ............... 27
Figura 23. Esquema da reação de acetilação das frações 13-30. ......................................... 28
Figura 24. Esquema de obtenção de compostos 1 a 7 a partir da F.MeOHsol.AcOEt. ....... 29
Figura 25. Esquema de reação de esterificação dos compostos 8 e 9. ................................ 31
Figura 26. Esquema de obtenção dos compostos 4,8-17 no Ext.AcOEt. ............................ 36
Figura 27. Reação de hidrólise do Ext.AcOEt. ................................................................... 37
Figura 28. Obtenção de geninas a partir do Ext.AcOEt. ..................................................... 38
vii
Figura 29. Papel de filtro previamente preparado, antes e depois da reação de hidrólise do
Ext.AcOEt. ........................................................................................................................... 39
Figura 30. Estrutura do ácido benzóico. .............................................................................. 45
Figura 31. Triterpenos isolados das folhas de P.locuples. .................................................. 46
Figura 32. Estrura do composto 8. ...................................................................................... 47
Figura 33. Esquema de obenção do composto 8a................................................................ 48
Figura 34. Estrutura do composto 9. ................................................................................... 49
Figura 35. Esquema de obtenção do composto 9a. ............................................................. 50
Figura 36. Mistura de compostos 2 e 3. .............................................................................. 50
Figura 37. Dissacáridos isolados de folhas de P. locuples. ................................................. 52
Figura 38. Estrutura de composto 4..................................................................................... 54
Figura 39. Estrutura e configurações do composto 4 e seu epímero (composto 5). ............ 55
Figura 40. Estrutura do composto 6. ................................................................................... 56
Figura 41. Estrutura e configuração do composto 6 e seu epímero (composto 7). ............. 57
Figura 42. Estrutura do composto 11. ................................................................................. 57
Figura 43. Estrutura do composto 12. ................................................................................. 58
Figura 44. Estrutura do composto 13. ................................................................................. 58
Figura 45. Estrutura do composto 14. ................................................................................. 59
Figura 46. Estrutura do composto 15. ................................................................................. 59
Figura 47. Estrutura do composto 16. ................................................................................. 60
Figura 48. Estrura do composto 17. .................................................................................... 60
Figura 49. Estrura do D-glucitol isolado das folhas de P. locuples. ................................... 65
Figura 50. Cromatograma do composto 10 analisado por GC/MS. .................................... 67
Figura 51. Espetro de massa de penta-O-acetil-1-O-metil-Dglucitol.................................. 68
Figura 52. Cromatograma das geninas analisadas por GC/MS. .......................................... 69
Figura 53. Espetro de massa de benzaldeido. ...................................................................... 69
Figura 54. Espetro de massa do ácido benzóico. ................................................................. 70
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.Especie do género Psydrax existentes em Moçambique ........................................ 4
Tabela 2. Espécie do género Psydrax inexistentes na preliminary checklist of vascular
plants of Mozambique. ........................................................................................................... 4
Tabela 3. Historial da pesquisa de informação refente a psydrax ......................................... 7
Tabela 4. Algumas espécies do género canthium popularmente utilizadas na medicina
tradicional. ............................................................................................................................ 13
Tabela 5. Frações obtidas do fracionamento de Ext.AcOEt. ............................................... 30
Tabela 6. Rendimento de extratos obtidos por maceração .................................................. 44
Tabela 7. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 8 (CDCl3) e 9 (CDCl3 + CD3OD). . 51
Tabela 8. Experimento HMBC do composto 4. .................................................................. 54
Tabela 9. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 4 e 14 (CDCl3) ................................ 61
Tabela 10. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 6 e 13 em CDCl3. ......................... 62
Tabela 11. Dados de RMN 13C e 1H dos compostos 11 e 15 em CDCl3. ............................ 63
Tabela 12. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 12 e 16 em CDCl3. ....................... 64
Tabela 13. Dados de RMN de 13C e 1H do composto 10 em CDCl3. .................................. 66
Tabela 14. Atividade antioxidade de extratos/frações de p. locuples (média±SD). ............ 71
Tabela 15. Atividade antitumoral de extratos/frações de folhas de P. locuples (média±SD).
.............................................................................................................................................. 72
Tabela 16. Atividade antitumoral de compostos isolados (média±SD). ............................. 74
ix
RESUMO
A humanidade sempre utilizou plantas medicinais como fonte primária no
tratamento de algumas doenças. Em África, as plantas do género Psydrax são popularmente
usadas na medicina tradicional para o tratamento de várias doenças e sintomas, incluindo
malária, febre, dores de cabeça, edema, reumatismo, diarreia, conjuntivites, micoses e
outras doenças inoficiosas. Existem estudos sobre os compostos presentes em algumas das
plantas do género mencionado e responsáveis pela sua bioatividade, mas pouco se sabe
sobre o perfil químico de Psydrax locuples (K. Schum.) Bridson. Assim, com o objetivo de
contribuir para a descoberta de novos constituintes e avaliação de propriedades bioativas
dessa espécie, foram realizados estudos com as folhas, muito utilizadas na medicina
tradicional no sul de Moçambique.
Os extratos foram preparados por maceração das folhas secas e moídas,
sequencialmente, com solventes de polaridade progressiva. Os compostos solúveis em
acetato de etilo, na maioria dos casos após acetilação, foram purificados por cromatografia
em coluna e preparativa em camada fina. A elucidação estrutural destes compostos foi feita
através da espetroscopia de RMN e espetrometria de massa (HRMS).
Foram isolados derivados acetilados de dois triterpenos (ácido ursólico e 11βhidroxiursólico) que, posteriormente, foram esterificados com trimetilsilildiazometano de
forma a converter o grupo carboxílico em éster metílico. Quer o composto 11βhidroxiursólico, quer os seus derivados eram desconhecidos. Também foram identificados
nove dissacáridos acetilados dos quais cinco são cianogénicos. Previamente, já haviam sido
descobertos numa planta de outra espécie, dois dissacáridos cianogénicos relacionados com
os isolados.
O potencial antioxidante dos extratos/frações foi determinado pela atividade
captadora de radicais 2,2-difenil-picril-hidrazilo (DPPH), poder redutor (PR) e inibição da
descoloração do β-caroteno. Todos os extratos/frações, apresentaram resultados
satisfatórios, principalmente os extratos de metanol e água (EC50DPPH = 0,29 e 0,32
mg/mL, respetivamente; EC50PR = 0,31 e 0,30 mg/mL, respetivamente; EC50β-caroteno =
0,52 e 0,31 mg/mL, respetivamente).
x
O potencial antitumoral foi avaliado in vitro, em quatro linhas celulares tumorais
humanos (HeLa, HepG2, MCF7 e NCI-H460), pelo método da sulforodamina B. Todos os
extratos e compostos isolados (sobretudo triperpenos e dissacáridos) revelaram atividade
inibitória do crescimento celular. O extrato de acetato de etilo acetilado foi o que
apresentou maior atividade em todas as linhas celulares testadas (80 µg/mL<GI50<219
µg/mL). A ausência de toxicidade dos extratos foi confirmada e ensaiada em culturas
primárias de células de fígado de porco (PLP2). Os resultados dos ensaios de bioatividade
vêm realçar o potencial medicinal das folhas de P. locuples tão utilizadas na medicina
tradicional em Moçambique.
xi
ABSTRACT
Since ancient times, mankind has used medicinal plants as primary source to treat
some diseases. In Africa, plants belonging to the genus of Psydrax are popularly used in the
traditional medicine to treat several symptoms and diseases, such as fevers, malaria, edema,
headache, rheumatic pains, diarrhea, conjunctivitis, mycoses and other infectious diseases.
There are available studies on the compounds present in some of the plants of the
mentioned genus and responsible for their bioactivity, but the chemical profile of Psydrax
locuples (K. Schum.) Bridson is still unknown. Therefore, in order to contribute to the
discovery of new compounds and evaluation of bioactive properties of this species, studies
with its leaves, highly used in the traditional medicine in south of Mozambique, were
carried out.
The extracts were obtained by sequential maceration of the powder of the dried
leaves of P. locuples using different solvents and increasing polarity.
The soluble compounds in ethyl acetate, most of the cases after their acetylation,
were purified by column and thin-layer preparative chromatographies. Their structural
elucidation was done by NMR spectroscopy and mass spectrometry (HRMS).
We have isolated acetylated derivative of two triterpenes (ursolic and 11βhydroxyursolic acids) that were subsequently esterified with trimetysilyldiazomethane to
convert the carboxylic to an ester group. 11β-Hydroxyursolic acid and its derivatives were
unknown compounds. Furthermore, nine diglycoside compounds, which five are
cyanogenic compounds, were also identified. Two cyanogenic diglycosides related with the
ones isolated in the present work were previously identified in other species.
Bioassays were conducted in order to know the biological potential of extracts and
isolated compounds. The antioxidant activity of all the extracts/fractions was evaluated
through DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical scavenging activity, reducing
power (RP) and β-carotene bleaching inhibition. All the extracts/fractions showed
satisfactory results, especially the methanolic and water extracts (EC50DPPH = 0.29 and
0.32 mg/mL, respectively; EC50RP = 0.31 and 0.30 mg/mL, respectively; EC50β-carotene =
0.52 and 0.31 mg/mL, respectively).
xii
The in vitro antitumor potential of all the extracts and isolated compounds was evaluated in
four human tumor cell lines (HeLa, HepG2, MCF7 and NCI-H460) by Sulforhodamine B
assay. All the extracts and isolated compounds (especially triterpenes and diglycosides)
showed results against tumor cell lines. The acetylated ethyl acetate extract expressed better
inhibition of the cell growth in all the lines tested (80 µg/mL<GI50<219 µg/mL). The
absence of toxicity of the extracts was confirmed in a primary culture of porcine liver cells
(PLP2).
The results obtained in the bioassays validate the medicinal potential of P.
locuples leaves, commonly used in the traditional medicine of Mozambique.
xiii
INTRODUÇÃO
A utilização de matrizes vegetais para fins terapêuticos é tão antiga quanto a
civilização humana e, por muito tempo, produtos minerais, vegetais e animais foram
fundamentais para a área da saúde. Historicamente, as plantas medicinais são importantes
como fitoterápicos e na descoberta de novos fármacos, estando no reino vegetal a maior
contribuição para a formulação de medicamentos (Rodrigues & Amaral, 2012).
As plantas superiores são fontes de milhares de produtos naturais, com uma variedade
quase infinita de estruturas diferentes. As suas moléculas têm, frequentemente, funções
específicas e muitas delas apresentam atividades biológicas que podem ser úteis para os
seres humanos (Hostettmann et al., 2008). Rodrigues & Amaral (2012) estimam que 5 mil
espécies foram já estudadas com fins medicinais. De facto, as plantas superiores formam
um pequeno grupo de cerca de 250 000 espécies, das quais apenas 6 % foram investigadas
farmacologicamente e 15 % fitoquimicamente (Heinrich et al., 2004; Rodrigues & Amaral,
2012).
As plantas dos trópicos e subtrópicos são bastante abundantes mas têm sido pouco
estudadas; inclusivamente, muitas delas ainda nunca foram estudadas e outras estão a
desaparecer antes de terem sido catalogadas botanicamente (del Fresno et al., 1999;
Hostettmann et al., 2008). Estas representam um enorme reservatório de novas moléculas
com potenciais atividades terapêuticas à espera de serem descobertas (Hostettmann et al.,
2008).
A Organização Mundial de Saúde (OMS), considerando as plantas medicinais como
importantes instrumentos de assistência farmacêutica, tem expressado, por meio de vários
comunicados e resoluções, a sua posição a respeito da necessidade de valorizar a sua
utilização no âmbito sanitário, sobretudo, ao observar que 70 % a 90 % da população nos
países em vias de desenvolvimento depende delas no que se refere aos cuidados primários
de Saúde (Rodrigues & Amaral, 2012). Segundo informações da OMS, descritas pelos
mesmos autores, 60 % da população mundial utiliza medicamentos tradicionais, baseados
numa história de utilização prolongada, com frequência milenar.
1
Segundo Lobo & Lourenco (2007), os princípios ativos são geralmente metabolitos
secundários cuja função ainda não é bem conhecida; alguns parecem não ser essenciais à
vida do organismo que os biossintetiza, outros são essenciais na comunicação da espécie,
outros ainda podem constituir defesas em caso de ataque. Heinrich et al. (2004) estimam
que cerca de 139 000 metabolitos secundários foram já isolados, sendo 16 833 alcaloides e
30 000 terpenos. Exemplos clássicos de drogas de origem vegetal, incluem o agente
antimalárico quinina, extraído a partir da casca de Cinchona officinales L. (Rubiaceae), o
analgésico morfina e o bem conhecido antitússico codeína, ambos extraídos de Papaver
somniferum L. [(opium) poppy] (Papaveraceae), a atropina extraída de Atropa belladonna
L. (atropa) com propriedades anticolinérgicas e outras espécies das Solanaceae, e a
digoxina extraída de Digitalis spp. (Scrophulariaceae), utilizada para o tratamento de
insuficiência cardíaca (Heinrich et al., 2004; Hostettmann et al., 2008).
Moçambique é um repositório importante de diversidade biológica. Esta diversidade
é usada por cerca de 90 % da população do país, maioritariamente das zonas rurais, para
satisfazer as suas necessidades habitacionais, energéticas, alimentares e de saúde. Em
Moçambique, cerca de 15 % do total dos recursos genéticos vegetais (estimado em cerca de
5500 espécies de plantas) é utilizado pelas comunidades rurais para fins medicinais e
desempenham um papel fundamental nos cuidados básicos de saúde (Senkoro et al., 2012).
Na região sul de Moçambique (províncias de Inhambane, Gaza e Maputo), usam-se as
folhas de Psydrax locuples (K. Schum.) Bridson para tratar e prevenir a "doença da lua",
doença caracterizada por febre, vómitos, diarreia, dor de cabeça, cólicas abdominais, e por
produzir sintomas e sinais idênticos aos da epilepsia, em recém-nascidos e crianças.
É neste âmbito, que o presente trabalho pretende caracterizar quimicamente e
avaliar as propriedades bioativas de folhas de Psydrax locuples (K. Schum.) Bridson.
Alguns dos compostos identificados serão isolados de forma a confirmar as moléculas
bioativas e responsáveis pelas propriedades observadas. Até então, desconhece-se a
composição química das folhas e ainda não foram confirmadas as propriedades bioativas
que suportam a sua utilização pelas populações do sul de Moçambique.
2
1. ESTADO DA ARTE
1.1. Família Rubiaceae
Segundo Coelho et al. (2006), a família Rubiaceae é a maior da ordem Gentianales,
com cerca de 650 géneros e 13 000 espécies, que corresponde a 66 % do total das
Gentianales. Entretanto, a subdivisão da família tem variado de acordo com o autor.
Estudos filogenéticos mais recentes propõem a divisão de Rubiaceae em três subfamílias:
Rubioideae, Cinchonoideae e Ixoroideae. Esta família está distribuída por todo o mundo
essencialmente nos trópicos e em regiões quentes (Heinrich et al., 2004). Coelho et al.
(2006), referem ainda que esta família possui espécies de grande importância económica,
que são exploradas como alimentares (Coffea arabica L. e Genipa americana L.),
ornamentais (Ixora spp., Mussaenda spp., Gardenia spp., etc.), e também na indústria
farmacêutica, como por exemplo Cinchona pubescens Vahl, produtora de quinina, utilizada
no tratamento da malária.
1.2. Género Psydrax
A Plant List (2010), um projeto internacional que visa montar um sólido banco de
dados de plantas, contando com a participação de institutos como Royal Botanic Gardens e
o Missouri Botanical Garden, incluem 80 espécies do género Psydrax. Segundo Hyde et al.
(2007), a Flora de Moçambique comporta 9 espécies de Psydrax, uma delas representada
com duas subespécies (Tabela 1).
3
Tabela 1. Espécie do género Psydrax existentes em Moçambique.
Psydrax
fragrantissima (K.Schum.) Bridson;
kaessneri (S. Moore) Bridson;
kraussioides (Hiern) Bridson;
livida (Hiern) Bridson;
locuples (K. Schum.) Bridson;
micans (Bullock) Bridson;
moggii Bridson;
obovata (Eckl. &Zeyh.) Bridson subsp.elliptica Bridson;
obovata (Klotzsch ex Eckl. &Zeyh.) Bridson subsp.obovata;
parviflora (Afzel.) Bridson subsp.chapmanii Bridson.
Adaptado de Hyde et al., (2013)
A Preliminary Checklist of the Vascular Plants of Mozambique, descrita por Da
Silva et al. (2004), refere a existência de apenas 7 espécies, não validando a presença em
Moçambique das seguintes espécies de Psydrax (Tabela 2).
Tabela 2. Espécie do género Psydrax inexistentes na preliminary checklist of vascular plants of Mozambique.
Psydrax
kaessneri (S. Moore) Bridson;
parviflora (Afzel.) Bridson subsp.chapmanii Bridson;
obovata (Eckl. &Zeyh.) Bridson subsp. Elliptica Bridson.
1.3. Psydrax locuples (K. Schum.) Bridson
1.3.1. Classificação científica
Seguindo o sistema de classificação das plantas com flor (angiospérmicas) proposto
por Chase & Reveal (2009), a espécie em estudo (Figura 1) classifica-se do seguinte modo:
Classe:
Equisetopsida
Subclasse:
Magnoliidae
4
Ordem:
Gentianales
Superordem: Asteranae
Família:
Rubiaceae
Género:
Psydrax
P. locuples (K. Schum.) Bridson
Figura 1. Psydrax locuples (K. Schum.)
Bridson.
1.3.2. Sinonímias
Canthium locuples (K.Schum.) Codd;
Plectronia locuples K.Schum (Germishuizen & Meyer, 2003).
1.3.3. Nomes vernaculares em Moçambique
Bandissa-lhoko, Shihlobongo (Da Silva et al., 2004).
1.3.4. Descrição
É uma árvore/arbusto perene com uma altura que varia entre 2-6 m, com um
padrão impressionante de ramificação; os ramos crescem em pares opostos exatamente em
ângulo reto com o ramo principal. As folhas são pequenas e brilhantes, com margens
onduladas. As flores são muito pequenas e brancas. Os frutos são bagas assimétricas,
5
brilhantes e negros. A sua propagação é feita através da semente (David & Nichols, 2002;
Germishuizen & Meyer, 2003).
1.3.5. Distribuição geográfica e habitat
Encontra-se em regiões quentes. Desenvolve-se em planícies costeiras ou dunas,
florestas, geralmente em solo arenoso ou sobre afloramentos de arenito e em declives de
montanhas rochosas. A taxa de crescimento é de cerca de 40 cm por ano. Tolera um pouco
o frio, mas cresce melhor em ambiente acolhedor, com chuvas moderadas (GBIF, 2000;
David & Nichols, 2002).
Em África, a espécie encontra-se distríbuida em Moçambique, África do Sul,
Suazilandia e Zimbabwe (GBIF, s.d). Em Moçambique, a espécie encontra-se nas
províncias de Inhambane, Gaza e Maputo (Da Silva et al., 2004).
1.3.6. Usos em Moçambique
As folhas frescas de P. locuples são utilizadas no alívio de dores de cabeça. As
folhas são esmagadas, e posteriormente, colocadas sobre a testa, amarradas com um lenço
de cabeça (Turner, 2002). Além deste uso, as folhas são também utilizadas para tratar e
prevenir a "doença da lua". Usam-se normalmente folhas dissecadas, maceradas em água
numa concha de caracol durante horas. A tisana resultante é administrada fria por via oral
nas primeiras horas da manhã e à noite a recém-nascidos e crianças até aos 5 anos de idade.
1.4. Composição química e propriedades bioativas de P. locuples
Após extensa pesquisa bibliográfica, não foram encontrados estudos sobre a
composição química e atividade farmacológica/propriedades bioativas desta espécie. Para a
revisão bibliográfica partiu-se, então, do seguinte pressuposto de Hostettmann et al. (2008):
6
"os componentes são muitas vezes específicos para uma família, género ou espécie. Se um
produto natural possui atualmente propriedades curativas interessantes, pode ser possível
encontrar espécies análogas num mesmo género ou na mesma família". Assim, optou-se
por fazer uma revisão bibliográfica sobre outras espécies já estudadas e pertencentes a
família Rubiaceae.
Para a recolha da informação referente à composição química e atividades
farmacológicas/propriedades bioativas de Psydrax, procedeu-se em outubro de 2013, a uma
pesquisa na ISI Web of knowledge [v5.13], onde se usou a seguinte estratégia (Tabela 3).
Tabela 3. Historial da pesquisa de informação refente a Psydrax.
Conjunto
Estratégia de pesquisa
Resultados
1
Tópico: (Psydrax)
18
2
Tópico: (Whipstickquar)
0
3
Tópico: (Canthium)
68
4
Tópico: (Plectronia ou Afrocanthium ou Cyclophyllum ou Keetia)
35
Total
102
Foram encontrados 102 artigos, que por sua vez, foram refinados através da leitura
dos títulos e resumos, tendo sido incluídos nesta secção do documento 45 artigos.
1.4.1. Composição química
Segundo Kouam et al.(2013), a família Rubiaceae é reconhecida como uma fonte
rica em compostos bioativos, incluindo iridoides, alcaloides e triterpenos. Os mesmos
autores referem ainda, que a maioria dos iridoides isolados nesta família foram descritos
como tendo um esqueleto ciclopentapirano, com o grupo funcional de éster metílico ou de
ácido carboxílico.
7
Estudos de investigação nas espécies do género Canthium, mostram que estas
contêm
caracteristicamente
compostos
como
iridoides,
terpenoides,
glucósidos
cianogénicos, glucósidos fenólicos e alcaloides (Kouam et al., 2013).
De acordo com os estudos iniciados por Herath et al. (1979) e complementados por
Gunasegaran et al.(2001), nas folhas e cascas do caule de C. dicoccum, foram isolados
diferentes compostos bioativos nomeadamente,-sitosterol (1), ácidos quinováico (2) e
acetil quinováico, rutina (3) e escopolatina (4) (Figura 2).
Figura 2. Compostos isolados das folhas e cascas do caule C. dicoccum.
Segundo Rockenbach et al. (1992) e Schwarz et al. (1996), o estudo das folhas e
frutos de C. huillense e C. shimperianum, culminou com o isolamento da prunasina (5),
seus derivados e outro novo glucósido cianogénico (6) (Figura 3).
Figura 3. Glucósidos cianogénicos isolados das folhas e frutos de C. huillense e C. shimperiam.
8
Outro estudo das partes aéreas de C. berberidifolium, realizados por Kanchanapoom
et al. (2002), também permitiu o isolamento do ácido genipósido (7), outro derivado
iridoico (10), piceina (8), e de vários glucósidos fenólicos (9, 11, 12, 13 e 14) (Figura 4).
Figura 4. Glucósidos e iridoides isolados da partes aéreas de C. berberidifolium.
O estudo da composição fitoquímica das folhas C. parviflorum Lam., efetuado por
Jose et al. (2008) e por Pasumarthi et al. (2011), permitiu isolar compostos bioativos como
β-sitosterol (1), taraxerol (15), D-manitol (16), petunidina (17) e glucósidos cardíacos (18),
incluindo ésteres, ácidos e álcoois de cadeia longa (Figura 5).
9
Figura 5. Compostos extraídos das folhas de C. parviflorum Lam.
Os estudos das raizes e folhas de C.multiflorum (Thonn.) Hier, indicaram presença
de derivados do ácido-28-ursólico hidroxilado (18), cumarinas metoxiladas (19):
escopolatina (4), escoparona e outros e derivado iridóico (20) (Traoré et al., 2008;
Coulibaly et al., 2009; Akomo et al., 2009) (Figura 6).
Figura 6. Compostos extraídos das folhas de C. multiflorum (Thonn.) Hier
Kouam et al. (2013), vieram complementar o estudo da planta C.multiflorum
(Thonn.) Hier, com o isolamento a partir da casca do caule, de vários metabolitos
secundários, incluindo ácido quinováico (2), manitol (15), 6-oxoginipina (21),
10
macrofilósido (22), garjasmine (23), gardenine (24), gardenamida (25), galiósido (26),
aitchisónido B (27), 6α-hidroxigenipósido (28), ácido diacetilasperulósido (29), ácido
vanílico 4-O-β-D-(6-O-benzoilglucopiranósido (30), ácido oleanólico (31) e um ácido
vanílico (32) (Figura 7).
Figura 7. Compostos extraídos da casca do caule de C. multiflorum (Thonn.) Hier.
Numa outra espécie de C. glaucum Hiern., Musila et al. (2013), para além dos
alcaloides e flavonoides, puderam também isolar lactonas sesquiterpénicas. Num outro
estudo com folhas e galhos de C. henriquesianum, efetuado por Ilboudo et al. (2013),
foram identificadas nos extratos aquosos, misturas de flavonoides, taninos hidrolisáveis e
saponinas.
Estudos biomonitorados com extratos da casca do caule C. horridum Bl.,
conduziram ao isolamento de dez compostos: β-sitosterol (1), manitol (16), cumarina
metoxilada
(19),
escopoletina
(4)
e
escoparona,
ácido
vanílico
4-O-β-D11
glucopiranósido(30), (+)-siringaresinol (33), 3'-metoxi-4'-hidroxi-trans-cinamaldeído (34),
aldeído sinápico (35) , ácido siríngico (36), e β-daucosterol (37) (Yang et al., 2010)
(Figura 8).
Figura 8. Compostos extraídos da casca do caule de C. horridum Bl.
1.4.2. Propriedades bioativas
Foram realizados vários estudos fitoquímicos em espécies do género Canthium, que
comprovaram a presença de vários metabolitos secundários. Segundo Musila et al. (2013),
estes metabolitos secundários, são responsáveis pelas atividades biológicas destas espécies.
De acordo com Bero et al. (2009) e Ilboudo et al. (2013), estas espécies são popularmente
usadas na medicina tradicional para o tratamento de várias doenças (Tabela 4).
12
Tabela 4. Algumas espécies do género canthium popularmente utilizadas na medicina tradicional.
Nome botânico
Parte usada
Indicações
Referência
Keetia leucantha (K.
Kruse) Bridson (syn.
Plectronia leucantha
Krause)
Folhas
Malária e doenças respiratórias
Koné et al.
(2004) e
Bero et al.
(2009)
Canthium multiflorum
(Thonn.) Hier
Folhas
Várias doenças, incluído febre, malária, dores
de cabeça, edema, reumatismo, diarreia,
conjuntivites, micoses e outras doenças
inoficiosas
Akomo et al.
(2009)
Raízes
Hipertensão
Traoré et al.
(2008)
Canthium mannii Hier
Cascas do
caule
Helmintíase
Pone et al.
(2009)
Canthium parviflorum
Lam.
Folhas
Anti-veneno e cicatrizante de feridas
Pasumarthi
et al. (2011)
Canthium sucordatum
(D.C.)
Raiz
Malária,
febre,
cardiovasculares
Canthium
henriquesianum (K.
Schum)
Parte aérea
Malária, tosse, diabetes e hipertensão
Kouam et al. (2013),
inflamação,
doenças
Awah et al.
(2012)
Ilboudo et al.
(2013)
atribuem aos iridoides várias activividades biológicas,
incluindo actividades citotóxica, antiplasmódica, antifúngia e antibacteriana.
1.4.2.1.
Propriedades antiparasitárias
1.4.2.1.1.
Atividade antiplasmódica
Segundo Bero et al. (2009), estudos in vitro de extratos de diclorometano,
metanólicos e aquosos de folhas e galhos de Keetia leucantha (K. Krause) Bridson (syn.
Plectronia eucantha Krause), mostraram que os extratos de diclorometano foram mais
ativos frente aos parasitas Plasmodium falciparum; resultados similares foram verificados
13
nos extratos de diclorometano obtidos a partir de raízes de C. multiflorum (Ilboudo et al.,
2013).
Estudos in vivo com extratos orgânicos de C. glaucum, realizados por Musila et al.
(2013), mostraram queestesconseguiam inibir o crescimento de parasitas de Plasmodium
berghei, comprovando deste modo que esta espécie era possuidora de atividade
antiplasmódica. Um outro estudo envolvendo o mesmo tipo de parasitas realizado por Bero
et al. (2013), comprovou que extratos orgânicos e aquosos de galhos de Keetia leucantha
eram significativamente ativos na inibição do crescimento desses parasitas. Os mesmos
autores ainda referem que os extratos eram constituídos por uma mistura de ésteres de
triterpenos que são possuidoras de atividade antiplasmódica. A presença de maior
quantidade destes ésteres triterpénicos, ácidos ursólico e oleanólico nos extratos de
diclorometano de Keetia leucantha pode justificar, em parte, a atividade antiplasmódica dos
extratos brutos. Estudos efetuados por outros autores revelaram que a atividade
antiplasmódica dos dois ácidos foi observada em duas experiências, uma vez que inibiram o
parasita Plasmodium falciparum com EC50 = 9,3 e 4,9 µg/mL e EC50 = 15,2 e 3,1µg/ml
para o ácido ursólico e oleanólico, respetivamente (Bero et al., 2011).
1.4.2.1.2.
Atividade antitripanossomial e antileishmanial
Bero et al. (2011), realizaram testes in vitro para a avalição da atividade
antitripanossomial e antileishmanial. Segundo os autores, foram preparados extratos de
diclorometano, metanólicos e aquosos de galhos de Keetia leucantha, as actividades foram
observadas nos extratos de diclorometano, pela inibição do crescimento do parasita
Tripanossoma brucei. Os mesmos autores referem que o extrato de diclorometano foi,
posteriormente fracionado, o que permetiu a identificação dosácidos ursólico e oleanólico
como componentes maioritários.Estes ácidos também foram testados relativamente às suas
atividades antitripanossomial e os resultados foram: EC50 = 1,0 ± 0,2 µg/mL e EC50 = 2,8±
0,5 µg/mL para os ácidos ursólico e oleanólico, respetivamente. Um outro estudo in vitro
de avaliação da atividade antitripanossomial envolvendo extratos de diclorometano de
folhas de Keetia leucantha e óleo essencial extraído de folhas da mesma planta, provou
14
mais uma vez que os ácidos betulínico, ursólico e oleanólico eram os maiores constituintes
no extrato e possuiam elevada atividade antitripanossomial; os compostos que tiveram
maior atividade no óleo essencial foram: geranilacetona, fitol, α-ionona e β-ionona (Bero et
al.,2013).
1.4.2.1.3.
Atividade nematicidal
A atividade nematicidal de extratos etanólicos de cascas do caule de Canthium
mannii foram avaliadas in vivo usando parasitas Heligmosomoides polygyrus, obtidos a
partir de fezes e duodeno de ratos adultos, tendo o extrato reduzido significativamente os
parasitas das fezes e do duodeno (75,0 % e 83,6 %, respectivamente), 7 dias após o
tratamento. A atividade do extrato pode ser atribuída à concentração de álcool e princípios
ativos anti-helmínticos solúveis que influenciam a vida do parasita. A atividade nematicidal
observada pode ser devida ao facto da casca do caule de C. mannii conter metabolitos
secundários tais como alcaloides, flavonoides, polifenóis e saponinas (Pone et al., 2009).
1.4.2.2.
Propriedades antibacterianas
Foram realizados estudos in vitro para avaliar as propriedades antimicrobianas de
extratos de espécies do género Canthium, utilizando o método de difusão de disco em agar.
De acordo com Akomo et al. (2009), foram preparados extratos metanólicos e aquosos de
folhas de C. multiflorum e submetidos a um teste in vitro usando vários microrganismos.
Após cerca de 11 horas de exposição, os resultados mostraram que todas as bactérias eram
suscetíveis a todos os extratos. No entanto, a suscetibilidade foi maior para o extrato
metanólico. O extrato revelou-se bactericida para Escherichia coli, Enterococcus faecalis,
Staphulococcus camorum, Staphulococcus aureus e Staphulococcus entérica, e
bacteriostático para Bacillus cereus.
Num outro estudo efetuado por Lagnika et al. (2011) com extratos metanólicos
obtidos a partir de partes aéreas de C. setosum (Keetia leucantha), demonstrou-se a sua
15
atividade antibacteriana pela inibição do crescimento de S. aureus, Pseudomonas
aeruginosa, E. faecalis e E. coli após 18 horas de incubação. Akomo et al. (2009) referem
que outros autores demonstraram nos seus estudos que a atividade antibacteriana é devida à
presença de compostos fenólicos nomeadamente, flavonoides, cumarinas e taninos.
1.4.2.3.
Atividade antioxidante e citotóxica
Foi avaliada in vivo a atividade antioxidante de extratos metanólicos obtidos a partir
de partes aéreas de C. setosum, utilizando o ensaio de captação de radicais DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazilo). Os resultados provaram que estes extratos eram possuidoras de
propriedades antioxidantes, cujo valor de EC50 foi de 3,47 µg/mL (Lagnika et al., 2011).
Segundo os mesmos autores, os extratos metanólicos eram maioritamente constituídos por
flavonoides. He et al. (2008), referem que a atividade antioxidante de vegetais está
principalmente relacionada coma presença de flavonoides.
Para o ensaio da atividade citotóxica, foram preparados extratos aquosos e
metanólicos de folhas de C. parviflorum e testados quanto ao seu efeito citotóxico na linha
celular de adenocarcinoma de cólon (Caco-2). O extrato metanólico mostrou ser um agente
citotóxico potente com uma EC50 de 52 µg/mL; o extrato aquoso revelou uma EC50 de 71
µg/mL. Nestes extratos, foram identificados vários metabolitos nomeadamente, saponinas,
taninos, flavonoides e glucósidos cardiotónicos (Pasumarthi et al., 2011). As saponinas
com um núcleo triterpénico, geralmente possuem atividade antitumoral, como é o caso do
α-fitol e do ácido betulínico (De Araujo et al., 2009).
16
2. OBJETIVOS
O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar quimicamente as folhas de
Psydrax locuples (k. Schum.) Bridson, e avaliar a sua bioatividade.
Como objetivos específicos foram considerados a:
-
Preparação de extratos de hexano, diclorometano, acetato de etilo, metanol e
água e correspondentes frações obtidos a partir de folhas de P. locuples;
-
Conhecimento da composição, isolamento e purificação dos compostos solúveis
em acetato de etilo utilizando métodos cromatográficos (CC e PTLC) e GC/MS;
-
Elucidação das estruturas dos compostos presentes utilizando técnicas
espectroscópicas: 1D e 2D RMN, HRMS e IV.
-
Avaliação da bioatividade dos diferentes extratos/frações/compostos obtidos
nomeadamente, atividade antioxidante e citotoxicidade em quatro linhas
celulares tumorais humanas e hepatotoxicidade usando uma cultura celular
obtida a partir de fígado de porco.
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material Vegetal
As folhas de Psydrax locuples (K. Schum.) Bridson foram colhidas em agosto de
2013, em Moçambique, na província de Maputo, no distrito de Marracuene pelo Prof.
Doutor François Munyemana. Após a sua colheita, procedeu-se à secagem, ao abrigo da luz
(Figura 9), durante 30 dias, no Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de
Química, Faculdade de Ciências, Universidade Eduardo Mondlane (UEM) /Maputo. Este
local possui condições adequadas para a secagem e armazenamento de órgãos de plantas
medicinais: condições de higiene, ventilação e proteção contra ataques de insetos e outros
animais. Para completar o processo de secagem as folhas foram colocadas na estufa a uma
temperatura entre 35 a 40 oC (Figura 10), durante duas horas.
Figura 9. Processo de secagem das folhas de P.
locuples, ao abrigo do sol.
Figura 10. Processo de secagem rápida das folhas
de P. locuples utilizando estufa.
Após a secagem, estas folhas foram trituradas em moinho elétrico de facas (figura
11) até à forma fina (figura 12), fornecendo cerca de 1,137 kg de material. Este material foi
identificado e devidamente guardado. Posteriormente foi enviado para a Universidade de
Salamanca (USAL), onde foi conservada até ao mês de fevereiro de 2014, período em que
se iniciaram os estudos num dos laboratórios do Departamento de Química Farmacêutica,
Faculdade de Farmácia, Salamanca (Espanha).
18
Figura 11. Moinho elétrico de facas utilizado para
triturar as folhas de P. locuples.
Figura 12. Folhas de P. locuples na forma fina.
3.2. Equipamentos e reagentes
Extração, fracionamento, isolamento e identificação de compostos
Todos os reagentes utilizados no processo de extração foram de grau analítico P.A,
com a exceção do hexano que foi purificado no laboratório. Para obtenção dos extratos,
assim como no processo de fracionamento, utilizou-se hexano, acetato de etilo, acetona,
metanol e n-butanol (Carlo Erba Reagents Group). A água destilada foi tratada num
sistema de purificação de água Millipore Direct-Q do Departamento de Química Analítica,
Nutrição e Bromatologia da USAL
Os extratos e frações foram concentrados sob pressão reduzida a temperatura de 40
o
C, em evaporador rotativo (Buchi R-210) acoplado a um banho de aquecimento (modelo
B-491) da mesma marca. No extrato aquoso, a água foi removida usando-se um liofilizador
(modelo Lyoquest) de marca Telstar.
A sílica gel 60 de granulação 0,063-0,200 mm (70-230 mesh ASTM) e sílica gel
P60 de granulação 40-63 µm (230-400 mesh) foram utilizadas para o empacotamento das
colunas (ambas da Merck).
Para a cromatografia em camada fina (TLC), foram utilizadas placas DCFotigfolien ALUGRAM®Sil G/UV254, com 0,20 mm de espessura da Macherey-Nagel.
As revelações das placas foram realizadas sob luz ultravioleta no Duo-UV-Source
for thin-layer and column cromatography de marca Desaga, a 254, 366 nm e ou por meio
19
de reação com uma mistura de ácido sulfúrico/etanol 96% (1:3), seguido de aquecimento da
placa na estufa a 100 oC.
As cromatografias preparativas em camada fina (PTLC) foram desenvolvidas em
placas de vidro de sílica gel 60 F254 (20x 20 cm, 1 mm de espessura) de procedência Merck.
Para a elucidação estrutural das substâncias isoladas foram utilizados os seguintes
equipamentos:
Espectrómetro de infravermelho: Nicolect Impact 410, utilizando pastilhas de KBr a
1% (m/m) ou em filme. Os valores de número de onda de máxima vibração (νMax)
expressam-se em cm-1.
Espectrómetro de ressonância magnética nuclear Varian modelo Mercury Vx 400
MHz (400 MHz para 1H e 100 MHz para
de RMN de 1H,
13
13
C), usado para a obtenção dos espetros
C e DEPT. Os espetros de COSY, HMQC, HMBC e ROESY,
foram obtidos em um espectrómetro Brucker (400 MHz para 1H e 100 MHz para
13
C). As amostras foram solubilizadas em clorofórmio (CDCl3) e metanol(CD3OD)
deuterados, CAMBRIDGE (Cambridge Isotope Laboratories). Nestas análises, foi
utilizado como referencial interno, o sinal do tetrametilsilano (TMS). Os
deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as
constantes de acoplamento (J), em Hertz (Hz).
Cromatógrafo de Gases Hewlett Packard 5890 Series II acoplado a um
espectrómetro de massas MSD Hewlett Packard 5972. A coluna cromatográfica é
uma HP-5MS (5 % de fenil) metilsilicona de 30 m, 0,25 mm de diâmetro interno e
0,25 micrómetros de espessura de película. Utiliza o He como gás inerte.
Os espetros de massas de alta resolução (HRMS): quadrupolo-tempo, modelo
Applied Biosystems QSTR XL, utilizando o elestrospray como modo de ionização a
5500 V e um detetor ESI-Q-TOF; os iões observados expressam-se em m/z.
A determinação do valor da atividade ótica [α] foi realizada num polarímetro Perkin
Elmer, modelo 241.
Os pontos de fusão dos compostos foram obtidos em graus Celsius em aparelho
Gallankamp de marca Sanyo.
20
Ensaios de bioatividade
Para a avaliação da atividade antioxidade foram usados os seguintes padrões: O 2,2difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) foi obtido na Alfa Aesar (Ward Hill, MA) e o trolox
(ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromato-2-carboxílico) foi adquirido à Sigma (St. Louis,
MO). O ácido tricloroacético (TCA) foi também adquirido à Sigma (St. Louis, MO).
Para a avaliação da atividade antitumoral e citotóxica foram usados as seguintes
soluções: o soro fetal bovino (SFB), a L-glutamina, a solução salina de Hank’s (HBSS), a
tripsina-EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), os aminoácidos não essenciais (2 mM),
a penicilina/estreptomicina (100 U/mL e 100 mg/mL, respetivamente), e os meios de
cultura RPMI-1640 e DMEM, que foram adquiridos à Hyclone (Logan).
O ácido acético, a elipticina, a sulforadamina B (SRB), o azul tripano e o Tris [2amino-2- (hidroximetil) propano-1,3-diol)], foram adquiridos à Sigma (St. Louis, MO).
A água destilada foi tratada num sistema de purificação de água Milli-Q (TGI Pure
water Systems) do Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada do Instituto Politécnico
de Bragança- IPB.
3.3. Obtenção de extratos de P. locuples
Os extratos foram obtidos por maceração (Figura 13) das folhas trituradas (secção
3.1.) utilizando diferentes solventes, tendo sido feitas duas extrações:
I.
Cerca de 100 g da amostra foram sucessivamente extraídas com hexano,
diclorometano, metanol e água (300 mL de cada solvente), à temperatura
ambiente e sob agitação constante. Os extratos foram filtrados a vácuo em funil
de Buchner (Figura 14) e posteriormente concentrados no evaporador rotativo
(Figura 15) a 40 oC, fornecendo cerca de 2,457 g de extrato de hexano, 3,500 g
de extrato de diclorometano, 32,536 g de extrato metanólico e 15,011 g de
extrato aquoso (Figura 16). A água do extrato aquoso foi removida no
liofilizador.
21
II.
Cerca de 200 g da amostra foram extraídas com hexano, duas vezes com
diclorometano e finalmente, com acetato de etilo (600 mL de cada solvente).
Esta extração forneceu cerca de 3,950 g de extrato de hexano, 5,571 g de extrato
de diclorometano I, 2,199 g de extrato de diclorometano II e 17,521 g de extrato
de acetato de etilo (Figura 17).
Figura 13. Extração por maceração dos extratos
de folhas de P. locuples.
Figura 14. Filtração a vácuo dos extratos de
folhas de P. locuples.
Figura 15. Remoção dos solventes nos extratos de folhas de P. locuples.
22
Figura 16. Sequência I de obtenção de extratos das folhas de P. locuples.
Figura 17. Sequencia II de obtenção de extratos das folhas de P. locuples.
23
3.3.1. Partição do extrato metanólico
Cerca de 5,1 g do extrato metanólico (Figura 16), foi particionada com água
destilada e acetato de etilo num funil de separação (Figura 18). Posteriormente, procedeuse à partição da fase aquosa remanescente com n-butanol.
Figura 18. Processo de partição do extrato metanólico.
As fases de acetato de etilo e n-butanol foram lavadas até pH neutro com solução
aquosa saturada de NaCl, secos com Na2SO4 anidro, filtrados e concentrados no evaporador
rotativo a 40 oC, obtendo-se assim o extrato metanólico solúvel em acetato de etilo
(Ext.MeOHsol.AcOEt), extrato metanólico solúvel n-butanol (Ext.MeOHsol.But) e extrato
metanólico solúvel em água (Ext.MeOHsol.H2O) (Figura 19), a água desta fase foi
removida no liofilizador (Figura 20)
Figura 19. Frações produzidas na partição do extrato MeOH.
24
Figura 20. Remoção de água no extrato aquoso de P. locuples.
3.3.2. Extração ácido-base da fração metanólica solúvel em acetato de etilo
(F.MeOHsol.AcOEt)
Cerca de 1,017 g da F.MeOHsol.AcOEt foi colocado num funil de separação e foi
particionado com AcOEt e NaOH (aq) 4% e (80:20, v/v). A fase aquosa remanescente foi
adicionada HCl
(aq)
2 N (30 mL) até ao pH ácido e depois particionada três vezes com e
AcOEt (70 mL). Finalmente, as duas fases foram lavadas com a solução aquosa saturada de
NaCl até ao pH neutro e secos (fase neutra com Na2CO3 anidro e fase ácida com Na2SO4
anidro), filtrados e concentrados no evaporador rotativo a 40 oC, resultando desta forma, a
fração neutra da fração metanólica solúvel em acetato de etilo (F.N.F.MeOHsol.AcOEt) e a
fração ácida da fração metanólica solúvel em acetato de etilo (F.A.F.MeOHsol.AcOEt)
(Figura 21).
Ilustração 21. Frações produzidas na extração ácido-base de F.MeOHsol.AcOEt.
25
Durante a remoção do solvente para se obter o F.A.F.MeOHsol.AcOEt, observou-se
a formação duma substância incolor em forma de agulhas nas paredes do balão. Após a
remoção total do solvente e posterior pesagem, notou-se a perda demasiada do peso da
fração.
A substância formada nas paredes foi recolhida num outro balão e dissolvida em
DCM. Após concentração no evaporador rotativo, obteve-se 5 mg desta substância
(composto 1). Ao analisar-se por RMN 1H, comprovou tratar-se de uma substância pura.
3.3.3. Fracionamento e isolamento
3.3.3.1.
Fração neutra do extrato metanólico solúvel em acetato de etilo
(F.N.F.MeOHsol.AcOEt)
A F.N.F.MeOHsol.AcOEt (281,0 mg) foi eluída numa coluna empacotada com
sílica gel 60. A coluna cromatográfica (Figura 22) foi preparada utilizando-se uma
proporção entre sílica e amostra de 1:50 (m/m) (Hostettmann et al., 2008). Num balão de
fundo redondo de 100 mL, colocou-se o extrato que foi dissolvido a quente numa mistura
de AcOEt e Me2CO, em seguida, adicionou-se 200 mg de sílica e levou-se ao evaporador
rotativo, ficando o extrato impregnado na sílica. O empacotamento da coluna com sílica gel
foi feito com hexano e, de seguida, aplicou-se a amostra que foi eluída primeiramente com
AcOEt e depois com a mistura de Me2CO e AcOEt, numa proporção de (2:8) e finalmente
com acetona, resultando 30 frações de 20 mL cada.
26
Figura 22. Realização da cromatografia em coluna de F.N.F.MeOHsol.AcOEt.
Após verificação sob luz ultravioleta e posterior revelação com a mistura
H2SO4/EtOH, foram reunidas de acordo com a semelhança de seus perfis cromatográficos,
somente as frações 7-8 (48,0 mg) e 13-30 (182,0 mg); entretanto, as outras frações não
foram estudadas porque apresentavam massas desprezáveis.
Nas frações 7-8, estava presente uma substância sólida amorfa. Analisada por TLC,
esta só foi visível a 366 nm e ao ser revelada com a mistura de H2SO4/EtOH e posterior
aquecimento, desenvolveu-se uma mancha cor rosa. Analisada por RMN de 1H e HRMS,
provou tratar-se duma mistura de compostos 2 e 3.
Dados espetroscópicos da mistura de compostos 2 e 3.
Mistura de compostos 2 e 3: P.f. 219-240 oC; IR (ν, cm-1): 2927, 1735, 1701, 1458, 1369,
1246, 1028. HRMS (ESI-TOF): calculado para C32H50O4 Na [M+Na]+: 521,3601;
encontrado: 521,3613 m/z.
i)
Acetilação das frações 13-30
Num balão de fundo redondo de 100 mL, colocou-se 182,0 mg das frações 13-30
(a) e dissolvidas em 1 mL de piridina, seguida de adição de 1 mL anidrido acético (b). Esta
reação ocorreu durante 12 h, ao abrigo da luz e sob agitação a temperatura ambiente e
monitorada através da TLC (Bhan et al., 1988). Após este período, adicionando-se gelo
picado para hidrolisar o excesso do anidrido acético. Após 1h, procedeu-se à partição da
27
mistura reacional com AcOEt e lavou-se sucessivamente a fase orgânica com uma solução
aquosa de HCl 2 N e soluções aquosas saturadas de NaHCO3 e NaCl resultante até pH
neutro. A fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro, evaporou-se o solvente, obtendo-se
deste modo 183,0 mg da fração 13-30 acetilada (c) (Figura 23), que foi confirmada através
de RMN 1H.
Figura 23. Esquema da reação de acetilação das frações 13-30.
As frações acetiladas (183,0 mg) foram submetidas a uma segunda cromatografia
em coluna e eluídas numa coluna empacotada com sílica gel flash P60. Para este caso,
dissolveram-se as frações em DCM e colocaram-se na coluna de separação. Foram
utilizadas os seguintes eluentes: DCM, DCM:AcOEt (9:1), (7:3), (1:1) e (2:8) e finalmente
AcOEt, resultando em 45 subfrações (recolhidas em tubos de ensaio 20 mL). A análise sob
luz ultravioleta e posterior revelação com a mistura H2SO4/EtOH, permitiu que se
juntassem, de acordo com os seus perfis cromatográficos, as frações 21-24 (67,0 mg) e 4149 (23,0 mg). As subfrações 21-24 eram compostas de composto 4 e seu epímero
(composto 5). Nas subfrações 41-49, estava presente o compostos 6 e seu epímero
(composto 7).
Dados espetroscópicos das misturas de estereoisómeros isolados
Mistura de compostos 4 e 5: HRMS (ESI-TOF): calculado para C36H43N2O16 [M+NH4]+:
759,2607; encontrado: 759,2618 m/z. RMN para 4 (R): H-7 Mn (5,55; s); C-8 Mn (117,1) e
RMN para 5 (S): H-7 Mn (5,74; s); C-8 Mn (116,7).
Mistura de compostos 6 e 7: HRMS (ESI-TOF): calculado para C37H51N2O16 [M+NH4]+:
779,3233; encontrado: 779,3230 m/z. RMN para 6 (R): H-7 Mn (5,48; s); C-8 Mn (117,1) e
RMN para 7 (S): H-7 Mn (5,70; s); C-8 Mn (116,6).
28
A Figura 24 ilustra o procedimento utilizado para a obtenção das frações e isolamento
dos compostos na F.N.F.MeOHsol.AcOEt, mencionados previamente.
Figura 24. Esquema de obtenção de compostos 1 a 7 a partir da F.MeOHsol.AcOEt.
3.3.3.2.
Extrato de acetato de etilo (Ext.AcOEt)
Começou por se proceder à acetilação de 2,0 g do Ext.AcOEt do mesmo modo
descrito na secção 3.3.3.1.i; para a sua dissolução, foram necessários 8 mL de piridina e 8
mL do anidrido acético. Após a partição obteve-se 2,282 g de Ext.AcOEt acetilado.
Cerca de 2,242 g de Ext.AcOEt acetilado, foi eluído numa coluna empacotada com
sílica gel 60 (98,0 g). A proporção entre sílica e amostra utilizada foi de 1:44 (m/m). Num
29
balão de fundo redondo de 100 mL colocou-se o extrato e foi dissolvido com hexano; de
seguida, adicionou-se 2 g de sílica e levou-se ao evaporador rotativo, permitindo deste
modo a impregnação do extrato na sílica. Eluiu-se utilizando-se hexano e AcOEt (9:1),
(8:2), (1:1) e (2:8), depois com o AcOEt e finalmente com a mistura de AcOEt e Me2CO
(8:2). Recolheram-se, portanto, 61 balões de fundo redondo de 100 mL, cada com 25 mL.
As frações foram reunidas em treze grupos de acordo com a semelhança do perfil
cromatográfico observado através de TLC (Tabela 5).
Tabela 5. Frações obtidas do fracionamento de Ext.AcOEt.
Grupos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Frações
26-27
28-34
35-39
40
41
42
43
44
45
46
47
48-50
51-54
65
144
86
91
129
302
344
381
237
121
60
142
146
Massa (mg)
Destes, foram estudados somente:
a) Grupo 1 (26-27) e 2 (28-34)
Estas frações destes grupos apresentaram-se como um sólido branco amorfo. Pela
análise por TLC, após revelação com a mistura de H2SO4/EtOH e posterior aquecimento,
observaram-se duas manchas rosas na placa. As duas frações foram misturadas e
dissolvidas em DCM. Foram submetidas a uma segunda CC e eluídas numa coluna
empacotada com sílica gel flash P60 (8,0 g). Procedeu-se à eluição com uma mistura de
Hex/AcOEt (9:1), (8,5:1,5), (8,3:1,7) e (7:3), resultando 16 subfrações de balões de fundo
redondo de 100 mL, cada com 25 mL. De acordo com o perfil observado na placa de TLC,
foram agrupados as subfrações: 1,2-3 (56,0 mg), 5-10 (34,0 mg) e 11-14 (17,0 mg).
As subfrações 1 e 2-3, após revelação com a mistura de H2SO4/EtOH e posterior
aquecimento, desenvolveu-se uma mancha rosa (composto 8). No entanto, o composto 8 da
subfracção 1 estava mais purificado em relação ao das subfrações 2-3.
As subfrações 5-10 e 11-14, após revelação com a mistura de H2SO4/EtOH e
posterior aquecimento, desenvolveu-se uma outra mancha rosa (composto 9). O composto
30
9 das subfrações 5-10, também se apresentou mais purificado em relação ao das subfrações
11-14.
Dados espetroscópicos e propriedades físicas dos compostos isolados:
Composto 8 (ácido acetilursólico): [α]D25 +0,450 (c 0,9; CHCl3). IR (ν, cm-1): 2927, 1735,
1701, 1458, 1369, 1246, 1028. HRMS (ESI-TOF): calculado para C32H50O4 Na [M+Na]+:
521,3601; encontrado: 521,3613 m/z. RMN 1H e RMN 13C (Tabela 7).
Composto 9 (ácido 11β-hidroxiacetilursólico): P.f. 225-235 oC; [α]D25 +0,050 (c 0,5;
CHCl3). IR (ν, cm-1): 2927, 1734, 1690,1458,1375, 1249 (Anexo 1). HRMS (ESI-TOF):
calculado para C32H49O4 [M+H]+: 497,3625; encontrado: 497,3624 m/z. RMN 1H e RMN
13
C (Tabela 7).
i)
Esterificação dos compostos 8 e 9
Em dois balões de fundo redondo de 100 mL foram colocados, num 22,0 mg do composto
8 e noutro 20,0 mg do composto 9. Ambos foram dissolvidos numa mistura de
tolueno/MeOH (10 mL, 3:2), seguida de adição de 2 mL de trimetilsilildiazometano
(TMSCHN2) 2 M como agente alquilante (Hashimoto et al., 1981). Esta reação ocorreu
durante 12 h à temperatura ambiente e monitorada por TLC (t = 0 e t = 12 h) (Figura 25).
Figura 25. Esquema de reação de esterificação dos compostos 8 e 9.
Passados 12 h, evaporou-se o solvente, obtendo-se deste modo 26,0 mg do
composto 8a (d) e 22,0 mg do composto 9a (d).
31
Dados espetroscópicos dos compostos esterificados:
Composto 8a (éster metílico do ácido acetilursólico): IR (ν, cm-1): HRMS (ESI-TOF):
calculado para C33H53O4 [M+H]+: 513,3938; encontrado: 513,3943 m/z. RMN 1H: 5,17 (H,
t); 4,42 (H, dd); 3,53 (3H, s); 1,98 (3H, s) ppm. RMN 13C: 178,1; 171,0, 138,2; 125,4; 81,0
e 51,6 ppm.
Composto 9a (éster metílico do ácido 11β-hidroxiacetilursólico): IR (ν, cm-1): HRMS
(ESI-TOF): calculado para C33H51O4 [M+H]+: 511,3782; encontrado: 511,3788 m/z. RMN
1
H: 5,42 (H; d; 3,2 Hz); 4,44 (2H, m); 3,54 (3H, s); 1,98 (3H, s) ppm. RMN
13
C: 177,8;
170,9; 144,8; 125,4; 81,6; 80,6 e 51,5 ppm.
b) Grupo 3 (frações 35-39)
Este grupo de frações foi submetido a cromatografia preparativa em capa fina
(PTLC), utilizando como sistema eluente a mistura Hex/AcOEt/Me2CO (8:1:1). Foram
efetuadas quatro eluições sucessivas que permitiram o isolamento de quatro compostos
nomeadamente: composto 10 (11,0 mg), 11 (11,0 mg), 4 (6,0 mg) e 8 (8,0 mg). Entretanto
os compostos 8, 4 e 11 estavam impuros. O composto 10 foi caracterizado por RMN e
confirmado por CG/MS.
Composto 10 (penta-O-acetil-1-O-metil-D-glucitol): HRMS (ESI-TOF): calculado para
C17H30NO11 [M+NH4]+: 424,1813; encontrado: 424,1822 m/z. RMN 1H e RMN
13
C
(Tabela 13).
c) Grupos 4 (fração 40) e 5 (fração 42)
Estes grupos (91,0 mg da fração 40 e 85,0 mg da fração 42) foram submetidos a
PTLC utilizando como sistema de eluente a mistura Hex/AcOEt/Me2O (6,5:1:2,5).
32
Efetuaram-se seis eluições sucessivas tendo, na terceira eluição, começado a formar-se um
precipitado branco (composto 4) na placa, que se ia concentrando em cada eluição.
Da PTLC da fração 40 foi possível isolar quantidade adicional do composto 10 (6,0
mg), perfazendo, portanto 17,0 mg desse composto. Além deste composto, foram isolados
destes grupos, outras quantidades adicionais dos compostos 4 (37,0 mg) e 11 (34,0 mg) e
uma mistura dos compostos 4 e 11 (64,0 mg). Nesta mistura, foi possível purificar o
composto 4, por meio de sua precipitação (gotas do eluente em uso e adição 2,0 mL de
hexano); assim, obteve-se 50,0 mg de precipitado branco (composto 4).
Dados espetroscópicos dos compostos isolados:
Composto 4 ((2R)-2,2’,3,3’,4-Penta-O-acetil-5’-O-benzoil-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-Dglucopiranosilmandelonitrilo): IR (ν, cm-1): 2937, 1754, 1602, 1452, 1372, 1220, 1112,
1066, 906, 714, 600. HRMS (ESI-TOF): calculado para C36H43N2O16 [M+NH4]+: 759,2607;
encontrado: 759,2618 m/z. RMN 1H e RMN 13C (Tabela 9).
Composto 11 (2,2’,3,3’,4-Penta-O-acetil-1,5’-di-O-benzoil-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-Dglucopiranosa): IR (ν, cm-1): 2926, 1752, 1636, 1452, 1373, 1241, 1064, 713. HRMS (ESITOF): calculado para C35H42NO17 [M+NH4]+: 748,2447; encontrado: 748,2456 m/z. RMN
1
H e RMN 13C (Tabela 11).
d) Grupos 10 (fração 46) e 11 (fração 47)
Estas duas frações foram reunidas (181,0 mg) e foram submetidas a uma PTLC
utilizando como sistema de eluente a mistura de Hex/AcOEt/Me2CO (6:2:2), onde foram
feitas quatro eluições sucessivas. Desta cromatografia foi possível isolar o composto 12
(31,0 mg), duas subfrações do composto 13 (30,0 e 13,0 mg) e duas subfrações do
composto 14 (11,0 e 12 mg). Entretanto, as subfrações do composto 13 assim como as do
composto 14 não foram reunidas porque havia diferenças de pureza entre elas.
33
Dados espetroscópicos dos compostos isolados:
Composto 12 (2,2’,3,3’,4-Penta-O-acetil-1-O-benzoil-5-O-[(E)-6-hidroxi-2,6-dimetilocta2,7-dienoil]-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucopiranosa): IR (ν, cm-1): 3519, 2930, 2110,
1747, 1647, 1452, 1371, 1241, 1065, 926, 714. HRMS (ESI-TOF): calculado para
C38H52NO18 [M+NH4]+: 810,3179; encontrado: 810,3172 m/z. RMN 1H e RMN
13
C
(Tabela 12).
Composto
13
((2R)-2,2’,3,3’,4-Penta-O-acetil-5-O-[(E)-6-hidroxi-2,6-dimetilocta-2,7-
dienoil]-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucopiranosilmandelonitrilo): IR (ν, cm-1): 3488,
2929, 1754, 1455, 1371, 1220, 1065, 925, 700. HRMS (ESI-TOF): calculado para
C39H53N2O17 [M+NH4]+: 821,3339; encontrado: 821,3342 m/z. RMN 1H e RMN
13
C
(Tabela 10).
Composto 14 ((2R)-2,2’,3,4-Tetra-O-acetil-5’-O-benzoil-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-Dglucopiranosilmandelonitrilo): IR (ν, cm-1): 3488, 2926, 1754, 1700, 1380, 1223, 1064,
1036, 717, 601. HRMS (ESI-TOF): calculado para C34H41N2O15 [M+NH4]+: 717,2501,
encontrado: 717,2500 m/z. RMN 1H e RMN 13C (Tabela 9).
e) Grupos 12 (frações 48-50) e 13 (frações 51-54)
As frações (48-50) do grupo 12 foram submetidas a uma PTLC utilizando como
sistema de eluente a mistura de Hex/AcOEt/Me2O (6:1,75:2.25), onde foram feitas seis
eluições sucessivas. Desta cromatografia foi possível isolar uma quantidade adicional de
composto 12 (4,0 mg) e composto 14 (4,0 mg) que estavam mais puros em relação aos
obtidos nas frações anteriores. Além destes compostos, foram isoladas outras subfrações de
impuras de compostos 6 (18 mg), que foram adicionadas às frações 51-54 para serem
purificadas.
34
O eluente utilizado para eluir as frações 48-50, foi utilizado na mesma proporção
para eluir dez vezes a PTLC das frações (51-54) do grupo 13, tendo-se isolado o composto
6 (32,0 mg), e outros novos: composto 15 (30,0 mg), composto 16 (14,0 mg) e uma mistura
(14,0 mg) de compostos 16 e 17 (derivado de 15), 6, 15 e dois compostos com P.M de 782
e 793 u.m.a, respectivamente, que não foi possível o seu isolamento.
Dados espetroscópicos dos compostos isolados:
Composto 6 ((2R)-2,2’,4-Tetra-O-acetil-5-O-[(E)-6-hidroxi-2,6-dimetilocta-2,7-dienoil]-βD-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucopiranosilmandelonitrilo): HRMS (ESI-TOF): calculado
para C37H51N2O16 [M+NH4]+: 779,3233; encontrado: 779,3230 m/z. RMN 1H e RMN
13
C
(Tabela 10).
Composto
15
(2,2’,3,4,5’-Penta-O-acetil-1-O-benzoil-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-
glucopiranosa): HRMS (ESI-TOF): calculado para C28H38NO16 [M+NH4]+: 644,2185;
encontrado: 644,2176 m/z. RMN 1H e RMN 13C (Tabela 13).
Composto 16 (2,2’,4-Tetra-O-acetil-1-O-benzoil-5-O-[(E)-6-hidroxi-2,6-dimetilocta-2,7dienoil]-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucopiranosa): HRMS (ESI-TOF): calculado para
C36H50NO17 [M+NH4]+: 768,30732; encontrado: 768,3067 m/z. RMN 1H e RMN
13
C
(Tabela 12).
Composto
17
((2R)-2,2’,3,4,5’-Penta-O-acetil-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-
glucopiranosilmandelonitrilo): HRMS (ESI-TOF): calculado para C29H39N2O15 [M+NH4]+:
655,2354; encontrado: 655,2345 m/z.
35
A Figura 26 ilustra o procedimento utilizado para a obtenção das frações e isolamento
dos compostos no Ext.AcOEt acetilado, mencionados previamente.
Figura 26. Esquema de Obtenção dos compostos 4,8-17 no Ext.AcOEt.
3.4. Obtenção de geninas do Ext.AcOEt
i) Reação 1
Num balão esmerilado de fundo redondo de 100 mL foi colocado 1,0 g do extrato
de acetato de etilo, dissolvido numa mistura de dioxano e água (14 mL, 1:1), seguida de
36
adição de 14,0 mL de ácido acético. A reação ocorreu sob refluxo num banho de silicone
sob agitação e a uma temperatura de 82 oC.
Figura 27. Reação de hidrólise do Ext.AcOEt.
A reação foi monitorizada por TLC nos tempos t = 0, 6, 20, 30 e 45 h da reação.
Passados 45 h, interrompeu-se a reação e deixou-se arrefecer, tendo a solução adquirido cor
alaranjada. Os produtos de hidrólise (geninas e os açúcares) foram obtidos por partição com
AcOEt/H2O, resultando duas fases, a orgânica e aquosa. A fase orgânica foi novamente
extraída com água. A fase orgânica foi lavada sucessivamente com solução saturada de
NaCl até ao pH neutro, seca em Na2SO4 anidro, filtrada e levada ao evaporador rotativo,
obtendo-se deste modo as geninas (479 mg). Evaporou-se a água da fase aquosa no
evaporador rotativo a 70 oC, obtendo-se deste modo os açúcares (491 mg). Após análise por
RMN 1H, notou-se que a reação de hidrólise foi incompleta.
ii)
Reação 2
Para a hidrólise completa destes, seguiu-se o procedimento realizado por Iwagawa
& Hase (1983), estes produtos foram novamente reunidos e colocados num balão do
mesmo tipo, dissolvidos em 7,0 mL de MeOH e seguiu-se com adição de 28,0 mL de HCl 2
N. A reação de refluxo ocorreu em 2,5 h a 137 oC, tendo-se novamente monitorizado esta
reação por TLC nos t = 0 e 2,5 h. Passado esse tempo, interrompeu-se a reação. Após o
arrefecimento, a solução permaneceu com a cor laranja e com um precipitado de cor creme
no fundo do balão. Depois, evaporou-se o MeOH e procedeu-se à partição de produtos de
37
hidrólise da mesma forma que se extraiu os produtos de hidrólise da reação 1, tendo se
obtido 329,0 mg de geninas (Figura 28).
As geninas foram caracterizadas por apenas CG/MS, para tal, 1 mg destas foram
dissolvidas em 1 mL de DCM e de seguida pipetou-se 1 µL da solução stock e injetou-se no
CG/MS, tendo se identificado dois compostos, o composto 1 e o composto 18.
Figura 28 . Obtenção das geninas a partir do Ext.AcOEt.
3.5. Reação de identificação do grupo ciano (CN) no extrato de acetato de etilo
(Ext.AcOEt)
Seguindo o procedimento efetuado por Brimer et al. (1983), na reação de hidrólise
(secção 3.4.), sob a boca do condensador, colocou-se um papel de filtro, previamente
preparado com duas soluções distintas, primeiramente mergulhado numa solução aquosa
saturada de ácido pícrico, tendo este tomado a cor da solução (amarela) e após secagem
rápida no secador, este foi mergulhado novamente numa outra solução aquosa de Na2CO3 2
M. Terminada a reação de hidrólise, notou-se no papel de filtro, a existência de uma cor
vermelho-tijolo (Figura 29).
38
Figura 29. Papel de filtro previamente preparado, antes e depois da reação de hidrólise do Ext.AcOEt.
3.6. Ensaios de bioatividade
Os extratos (secção 3.3.), frações (secção 3.3.1.) assim como as geninas (secção
3.4.) obtidos, foram avaliados quanto à sua bioatividade (atividades antioxidante e
antitumoral) no Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada do Centro de Investigação
de Montanha (CIMO) do Instituto Politécnico de Bragança (IPB), Portugal.
3.6.1. Avaliação da atividade antioxidante
Para este ensaio utilizou-se 10,0 mg de cada extrato/fração que foram dissolvidas
em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Posteriormente, realizaram-se diluições sucessivas
da solução mãe (10,0 mg/mL), utilizando-se o mesmo solvente para as seguintes
concentrações: 5,0; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,15625; 0,078; 0,039 e 0,019 mg/mL. Neste
ensaio, o Trolox (antioxidante comercial) foi utilizado como controlo positivo. Foram
avaliadas todas as amostras em triplicado com a exceção do poder redutor que foi em
duplicado. Os resultados foram expressos em valores de EC50 (concentração da amostra
responsável por 50% de atividade antioxidante ou 0,5 de absorvância no ensaio do poder
redutor, expressos em µg/mL).
39
3.6.1.1.
Atividade captadora de radicais livres DPPH
Misturaram-se as soluções das amostras nas várias concentrações (0,30 mL) com
uma solução de metanol (0,27 mL) contendo radicais de DPPH (6x10-5 mol/L). Após um
intervalo de 60 min de incubação à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, mediu-se a
redução do radical livre DPPH através da leitura da absorvância a 515 nm no leitor de
microplacas ELX800 (equipamento Bio-Tek, Inc.) (Guimarães et al., 2013).
A atividade captadora de radicais (RSA) foi calculada em função da percentagem da
descoloração da solução de DPPH, conforme a seguinte equação: %RSA= [(ADPPHAS)/ADPPH]x100, sendo AS a absorvância da solução na presença das varias
concentrações de amostra e ADPPH a absorvância da solução de DPPH. A concentração de
extração/fração capaz de inibir 50% de radicais DPPH (EC50) foi calculada a partir do
gráfico de percentagem RSA em função da concentração de amostra.
3.6.1.2.
Poder redutor
As soluções das amostras nas várias concentrações (0,5 mL) foram misturadas com
tampão fosfato de sódio (200 mmol/L, pH 6,6, 0,5mL) e ferricianeto de potássio (1%, 0,5
mL). As amostras foram incubadas a 50º C durante 20 min e adicionou-se posteriormente
ácido tricloroacético (10%, 0,5 mL). O sobrenadante (0,8 mL) foi colocado numa
microplaca de 48 poços juntamente com água destilada e cloreto de ferro (0,1%, 0,16 mL)
(Guimarães et al., 2013). A absorvância foi medida a 690 nm, no leitor de microplacas,
referido anteriormente. A concentração de amostra que fornece 0,5 de absorvância foi
calculada a partir do gráfico de absorvância 690 nm em função da concentração da amostra.
3.6.1.3.
Inibição da descoloração do β-caroteno
Preparou se uma solução de β-caroteno (2 mg) em clorofórmio, transferindo se 2
mL desta solução para um balão de fundo redondo para remoção do clorofórmio a 40º C,
40
sob vácuo. Adicionaram-se o ácido linoleico (40 mg), o emulsionante Tween 80 (400 mg) e
água destilada, agitando-se vigorosamente. Transferiram se 4,8 mL desta solução para cada
tubo de ensaio contendo as soluções das amostras nas várias concentrações (0,2 mL)
(Guimarães et al., 2013). Agitaram-se os tubos homogeneizando a mistura e mediu-se,
imediatamente, a absorvância a 470 nm (equipamento Analytik jena, modelo SPECORD
200) no tempo zero. Para a medição do tempo 1 colocaram se os tubos em banho (50º C,
2h) com agitação (50 rpm). A inibição da descoloração do β-caroteno foi calculada em
função da equação: β-caroteno (tempo 1)/β-caroteno (tempo 0)x100. A concentração de
amostra capaz de inibir 50% da oxidação do β-caroteno (EC50) foi calculada a partir do
gráfico de percentagem de inibição da descoloração do β-caroteno em função da
concentração da amostra.
3.6.2. Avaliação do potencial antitumoral e citotoxicidade
Para o screening de atividade antiproliferativa in vitro foram selecionadas quatro
linhas celulares tumorais humanas, assim designadas: MCF-7 (adenocarcinoma de mama),
NCI-H460 (cancro de pulmão), HeLa (carcinoma cervical) e HepG2 (carcinoma
hepatocelular) e uma cultura primária de células de fígado de porco: PLP2 (porcine liver
primary cell culture estabelecida no laboratório onde decorreram os estudos).
As amostras preparadas na secção 3.6.1. foram dissolvidas em dimetilsulfóxido
(DMSO)/água (1:1) de forma a obter a concentração final de 5,0 mg/mL. Após diluições
sucessivas da solução stock (5,0 mg/mL), preparam-se 5 novas concentrações. Estas
soluções foram adicionadas na placa de 96 poços de forma a obter as seguintes
concentrações: 250; 62,5; 15,625; 3,906; 0,977μg/mL. De forma análoga, foram também
preparadas amostras de compostos e misturas isolados da F.MeOHsol.AcOEt (secção
3.3.3.1.) e do Ext.AcOEt acetilado (secção 3.3.3.2.). Foram feitos pelo menos três ensaios
em duplicado para cada amostra. Os resultados foram expressos em valores de GI50
(concentração da amostra responsável por 50% de inibição do crescimento celular;
expressos em µg/mL. Neste ensaio, a elipticina foi usada como controlo positivo.
41
3.6.2.1.
Atividade
antiproliferativa
em
linhas
celulares
tumorais
humanas
As células foram mantidas em cultura de células aderentes em meio RPMI-1640
contendo 10% de Soro Fetal de Bovino (SFB) inativado pelo calor e 2 mM de glutamina
(MCF-7, NCI-H460, HeLa e HepG2, a 37 °C, em incubadora com temperatura
humidificada contendo 5% de CO2 (HF 151, Heal Force) (Guimarães et al., 2013). Todas as
experiências foram realizadas em ambiente asséptico numa câmara de fluxo laminar
vertical (TLStar, AV-30/70). Retirou-se o meio de cultura de cada caixa de cultura com as
respetivas linhas celulares. Adicionou-se o meio de lavagem (HBSS, 2mL) e após a sua
remoção adicionou-se tripsina (1,0mL). A caixa de cultura foi colocada na incubadora
durante 3 min para desagregação das células. Adicionou-se rapidamente meio de cultura (3
mL) para inativar a tripsina. A suspensão celular foi transferida para um tubo de falcon
estéril e posteriormente centrifugada (1200 rpm, 5 min.). O sobrenadante foi rejeitado e as
células foram ressuspensas em meio de cultura. Retiraram-se 50 µL de suspensão e
adicionaram-se 50 µL de solução de azul tripano para contagem do número de células
numa câmara de Neubauer.
Cada linha celular foi plaqueada numa densidade apropriada (7,5×103 células/poço
para MCF-7, NCI-H460 e HCT-15 ou 1,0×104 células/poço for HeLa e HepG2) numa placa
de 96 poços. Adicionaram 10 µL de cada concentração das amostras em cada poço e 190
µL da suspensão celular anteriormente preparada. As microplacas foram incubadas durante
48h até ao teste da sulforodamina B (SRB). Neste teste, adicionou-se a cada poço ácido
tricloroacético frio (TCA, 10%; 100 µL), incubando-se de seguida durante 60 min a 4º C.
As microplacas foram lavadas com água destilada e secas. A solução de SRB (0,1% em 1%
acido acético; 100 µL) foi adicionada a cada poço. A placa foi incubada durante 30 min à
temperatura ambiente. Posteriormente, lavou-se a placa com ácido acético (1%) para
remover o excesso de SRB e secou-se. A SRB foi solubilizada com 10 mM de Tris (200
µL, pH 7,4) num agitador de microplacas (Stat Fax-2100). A absorvância foi medida a 540
nm num leitor de microplacas (referido anteriormente).
42
3.6.2.2.
Hepatotoxicidade em células não tumorais
Preparou-se uma cultura de células primárias a partir de fígado fresco de porco,
obtido num matadouro local, designada por PLP2. O procedimento foi descrito
anteriormente pelo grupo de investigação em que se insere este trabalho (Abreu et al.,
2011). Os tecidos foram lavados em solução salina de Hank contendo 100 U/mL de
penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina e dividido em explantes de 1x1 mm3. Os
explantes foram colocados em caixas de cultura com meio DMEM suplementado com SFB
(10%), 2 mM de aminoácidos não essenciais, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de
estreptomicina, e colocou-se na incubadora. O meio de cultura foi trocado a cada 2 dias,
monitorizando-se utilizando um microscópio de invertido (Nikon Eclipse Ts 100). As
células foram transferidas para uma placa de 96 poços com uma densidade de 1x104
células/poço, e cultivadas em meio DMEM com 10% de SFB, 100 U/mL de penicilina e
100 µg/mL de estreptomicina. As células foram tratadas com diferentes concentrações de
amostra e efetuou-se o teste SRB anteriormente descrito.
43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Extratos obtidos de folhas P. locuples e seus rendimentos
O processo de extração de folhas trituradas de P. locuples apresentou os rendimentos
conforme a Tabela 6.
Tabela 6. Rendimento de extratos obtidos por maceração
Extração I (100 g)
Extração II (200 g)
Extratos
Tempo (h)
Hexano
70
2,457 g (2,56%)
44
3,950 g (1,98%)
Diclorometano (i)
48
3,500 g (3,50%)
67
5,571 g (2,79%)
Diclorometano (ii)
-
-
22
2,199 g (1,01%)
Acetato de etilo
-
-
70
17,521 g (8,76%)
Rendimento*
Tempo (h)
Rendimento**
Metanólico
45
32,536 g (32,54%)
-
-
Aquoso
69
15,011 g (15,01%)
-
-
* Extração em 300 mL de cada solvente
** Extração em 600 mL de cada solvente
O elevado rendimento do extrato metanólico (32,54%) condicionou a existência
duma etapa intermediária de extração entre os solventes diclorometano e metanol, para tal,
utilizou-se o acetato de etilo, permitindo deste modo a obtenção do extrato de acetato de
etilo (8,76%) que foi o nosso objeto de estudo.
4.2. Compostos isolados das folhas de P. locuples
Os procedimentos descritos na metodologia possibilitaram o fracionamento e
isolamento de dois triterpenos, nove dissacáridos e um glicitol.
Na
extração
ácido-base
da
fração
metanólica
solúvel
em
acetato
de
etilo
de
etilo
(F.MeOHsol.AcOEt), foram produzidas duas frações:
a) Fração
neutra
da
fração
metanólica
solúvel
em
acetato
(F.N.F.MeOHsol.AcOEt), donde foram isoladas:
Uma mistura de triterpenos e;
44
Duas misturas de dissacáridos.
Presume-se que a extração ácido-base efetuada na fração metanólica solúvel em
acetato de etilo, tenha criado as seguintes inconveniências:
1. A não obtenção de compostos puros;
2.
A obtenção de mistura dos triterpenos na fração neutra;
3. A perda demasiada do peso na fração ácida da fração metanólica solúvel em acetato
de etilo (F.A.F.MeOHsol.AcOEt) durante a sua concentração no rotavapor, devido a
utilização do HCl(aq)., que provavelmente pode ter
hidrolisado os dissacáridos
cianogénicos, desprendendo o HCN (detetado por reação com o ácido pícrico
descrita na secção 3.5.), e o benzaldeido (composto 18).
4.
A epimerização dos dissacáridos cianogénicos 4 e 6 produzindo seus respetivos
epímeros (artefactos). A utilização do NaOH(aq), para além de ter epimerizado os
dissacáridos cianogénicos também hidrolisou as funções ésteres, desprendendo o
ácido benzóico (composto 1) e o monoterpeno (não detetado nas geninas
hidrolisadas por GC/MS).
b) A
fração
ácida
da
fração
metanólica
solúvel
em
acetato
de
etilo
(F.A.F.MeOHsol.AcOEt), donde foi obtido o composto 1 (Figura 30). Este
composto foi obtido durante a concentração desta fração no evaporador rotativo a
40 oC e foi obtido como um cristal sólido branco e solúvel em diclorometano. Foi
analisada por RMN 1H e, de acordo com as características do seu espetro
comprovou-se tratar-se de uma substância pura e portanto, foi comparada com uma
amostra autêntica em TLC, tendo-se constatado se tratar do ácido benzóico.
Figura 30. Estrutura do ácido benzóico.
45
Com a acetilação do extrato de acetato de etilo (Ext.AcOEt acetilado) permitiu o
isolamento dos triterpenos e dissacáridos na forma pura.
As estruturas de todos os compostos/misturas foram elucidadas com base nas
análises dos dados espectroscópicos IV, HRMS, RMN 1H e 13C (DEPT 90o e 135o), COSY,
HMQC, HMBC, ROESY e GC/MS e por comparação com os dados disponíveis na
literatura. Com base nos espetros de RMN dos compostos isolados, fez-se as Tabelas 9 a 15
(dados espetrais de RMN) que permitiram a melhor visualização dos deslocamentos
químicos dos sinais de cada composto.
4.2.1. Triterpenos pentacíclicos
Os triterpenos foram isolados da fração neutra da fração metanólica solúvel em
acetato de etilo (F.N.F.MeOHsol.AcOEt) e do extrato de acetato de etilo acetilado
(Ext.AcOEt acetilado) (Figura 31).
Figura 31. Triterpenos isolados de folhas de P. locuples.
A mistura de compostos 2 e 3 foi isolada duma das frações proveniente da CC de
sílica gel da F.N.F.MeOHsol.AcOEt. Uma das particularidades destes triterpenos é de
serem visíveis (cor rosa) na placa de TLC, quando revelados com a mistura de
H2SO4/EtOH seguido de aquecimento na placa.
46
Os compostos 8 e 9 foram isolados duma das frações proveniente CC de sílica gel
do Ext.AcOEt acetilado, estas frações sofreram uma segunda CC de sílica gel dando origem
a estes compostos.
Os compostos 8a e 9a foram obtidos da esterificação dos compostos 8 e 9,
respetivamente.
4.2.1.1.
Elucidação estrutural
Composto 8 (Figura 32), sólido branco amorfo, solúvel em acetato de etilo. A sua
fórmula molecular C32H50O4 foi deduzida a partir do pico de ião [M+Na] + a m/z = 521,3601
no seu espetro de HRMS. Este composto exibiu duas bandas (1735 e 1701 cm-1) no espetro
de IV na região de grupos carbonilos, correspondentes a um grupo éster e um grupo ácido
carboxílico, respetivamente. O seu espetro DEPT revelou presença de oito carbonos
metílicos, nove carbonos metilénicos e seis carbonos monoprotonados. Pelo espectro de
RMN 13C (Tabela 7) observam-se sinais a 184,3 e a 171,1 ppm onde o primeiro é referente
ao grupo carboxílico e o segundo a éster. A existência de um sinal de C-3 a 80,9 ppm,
sugere que C-3 está ligado a um acetato, sinais a 125,7 e 137,9 ppm relativos à ligação
dupla entre C-12 e C-13. Estes últimos sinais, relacionando-os com o sinal de hidrogénio
olefínico presente no espetro de RMN 1H a 5,16 (t; 3,4; H-12), permitem definir um
triterpeno do tipo ursano. Estes dados foram comparados com dados de RMN de um
triterpeno caraterizado por Taketa, et al. (2004) e são totalmente iguais, portanto chegou-se
a conclusão de que o composto em análise é um ácido acetilursólico.
Figura 32. Estrutura do composto 8.
47
Os espetros de RMN 2 D (HMQC, HMBC, COSY e ROESY) concordaram com a
estrutura deste composto.
Composto 8a sólido branco amorfo, solúvel em acetato de etilo. Este composto é
produto da reação do composto 8 com o trimetilsilildiazometano (Figura 33). Seu espetro
de HRMS exibiu um pico de ião [M+H] + a m/z = 513,3938, o qual deduzido, corresponde a
fórmula molecular C33H53O4. Os espectros de RMN deste composto, se diferenciam com os
do composto 8 (Tabela 7) pela presença neste em análise de deslocamento do sinal
correspondente ao carbonilo do ácido carboxílico de 184,3 a 178,1 ppm e pela presença de
um novo grupo metoxilo (3,53 s, 51,6 ppm), confirmando a estrutura de éster metílico do
ácido acetilursólico.
Figura 33. Esquema de obtenção do composto 8a.
Composto 9 (Figura 34) sólido incolor, solúvel em acetato de etilo. O espetro de
HRMS exibiu o pico de ião [M+H] + a m/z = 497,3624 correspondente a fórmula molecular
C32H49O4, que corresponderia com um composto semelhante a 8 mas com uma insaturação
a mais. Da mesma forma que o composto 8, o seu espetro de IV exibiu também duas
bandas (1734 e 1690 cm-1) na região de grupos carbonilos, correspondentes a um grupo
éster e um grupo ácido carboxílico, respetivamente. Os seus espetros de RMN 1D e 2 D são
muitos parecidos ao do composto 8 (ácido acetilursólico), no entanto, há algumas
diferenças. No Espetro de RMN 1H (Tabela 7) o sinal de hidrogénio olefínico H-12 em
48
lugar de ser um tripleto, no composto 9 é um doblete, o qual indicaria a presença de um
substituinte sobre o C-11. Além disso o valor do integral do sinal que aparece a 4,38 ppm
corresponderia a dois hidrogénios o qual sugeriria a existência de um segundo hidrogénio
geminal a átomo de oxigénio adicional a H-3. Espetro de RMN de
13
C deste composto
exibiu dois sinais de carbono metílico (CH) unido a oxigénio (80,7 e 81,1 ppm) que
corresponderiam com C-3 e C-11, respetivamente. Segundo o que se descreve na
bibliografia, o sinal do C-11 de 11-hidroxitriterpenos insaturados na posição 12 aparecem
aproximadamente a 81 ppm se tratar-se uma configuração 11β-hidroxi, e a
aproximadamente 68 ppm se for uma configuração 11α-hidroxi (Lima, et al., 2005). Desta
forma o ião observado no experimento HRMS não corresponderia ao ião [M+H]+ mas sim
seu produto de desidratação [M-H2O+H]+. Sendo assim, a fórmula molecular deste
triterpeno seria C32H50O5 (ácido 11β-hidroxiacetilursólico). O grupo OH da posição 11β se
encontraria estericamente impedido para a sua acetilação. Este composto e o composto sem
acetilar 3 (ácido 11β-hidroxiursólico) são dois triterpenos não descritos até ao momento.
Figura 34. Estrutura do composto 9.
Composto 9a sólido incolor, solúvel em acetato de etilo. Este composto é produto
da reação do composto 9 com o trimetilsilildiazometano (Figura 35). Seu espetro de
HRMS exibiu um pico de ião [M+H] + a m/z = 511,3782, o qual deduzido, corresponde a
fórmula molecular C33H51O4. Este fórmula não corresponderia com a estrutura de 9a mas
sim, com o seu produto de desidratação. Os espectros de RMN deste composto se
diferenciam as do composto 9 (Tabela 7) pela presença no composto em análise do sinal do
grupo carbonilo do ácido carboxílico deslocado de 180,1 à 177,8 ppm e pela presença de
49
um novo grupo metoxilo (3,54 s, 51,5 ppm), confirmando a estrutura de éster metílico do
ácido 11β-hidroxiacetilursólico.
Figura 35. Esquema de obtenção do composto 9a.
Mistura de compostos 2 e 3 (Figura 36) sólido branco amorfo, solúvel em acetato
de etilo em proporção 2:1. Segundo a discussão realizada para os compostos 8 e 9 e os
dados espetroscópicos que aparecem na bibliografia se pode concluir que o composto 2 é
ácido ursólico, um triterpeno muito abundante no reino vegetal e o composto 3, é o ácido
11β-hidroxiursólico, um triterpeno que ainda era desconhecido até ao momento.
Figura 36. Mistura de compostos 2 e 3.
50
Tabela 7. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 8 (CDCl3) e 9 (CDCl3 + CD3OD)
Composto 8
Carbono
13
Ca
1
Composto 9
Ha,b
13
Ca
Ha,b
1
1
38,2
38,5
2
23,6
23,3
3
80,9
4,43 (H; dd; 8,4; 7,6)
80,7
4,38 (H, m)
4
37,9
-
37,5
-
5
55,2
54,9
6
18,1
18,0
7
32,8
8
39,4
-
41,7
-
9
47,4
1,46 (2H; t)
49,4
1,69 (H; d; 10,1)
10
36,7
11
23,3
1,83 (2H; m)
81,1
4,38 (H, m)
12
125,7
5,16 (H; t, 3,4)
125,5
5,41 (H; d; 3,6)
13
137,9
-
143,1
-
14
41,8
-
42,6
-
15
28,1
29,3
16
24,0
23,7
17
47,9
-
47,0
-
18
52,4
2,16 (H, d; 11,6)
51,7
2,18 (H; d; 10,9)
19
38,8
38,6
20
39,0
38,7
21
30,6
30,2
22
37,7
37,4
23
27,9
27,8
24
16,7
16,2
25
15,5
16,2
26
17,0
16,5
27
23,5
22,0
28
184,3
29
17,1
17,8
30
21,3
20,6
OCOCH3
21,2
33,0
36,3
-
180,1
2,03 (3H, s)
OCOCH3 171,1
a
Deslocamento químico,δ, em ppm.
,J, em Hz).
Valores de 1H mais significativos.
20,8
b
-
1,98 (3H, s)
171,6
(Número de H, multiplicidade, constante de acoplamento
51
4.2.2. Dissacáridos
Os dissacáridos foram isolados da fração neutra da fração metanólica solúvel em
acetato de etilo (F.N.F.MeOHsol.AcOEt) e do extrato de acetato de etilo acetilado
(Ext.AcOEt acetilado) (Figura 37)
Figura 37. Dissacáridos isolados de folhas de P. locuples.
As duas misturas contendo os compostos 4 e 6 com seus epímeros 6 e 7 foram
isoladas duma das frações proveniente da fração acetilada que foi submetida a uma segunda
CC. Esta fração acetilada é proveniente da CC de sílica gel da F.N.F.MeOHsol.AcOEt.
Os compostos 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15 e mistura de compostos 16 e 17 foram
isolados de frações provenientes da cromatografia em coluna de sílica gel de Ext.AcOEt
52
acetilado, para o seu isolamento, as frações foram submetidas a sucessivas cromatografias
preparativas em camada fina (PTLC).
4.2.2.1.
Elucidação estrutural
Composto 4 (Figura 38) é sólido branco em forma de precipitado, solúvel em
diclorometano. Seu espetro de HRMS exibiu um pico de ião [M+NH4] + a m/z = 759,2618,
o qual deduzido, corresponde a fórmula molecular C36H39NO16. Esta fórmula molecular
sugere a existência de dezoito insaturações. Pelo espetro de
13
C verificam-se sinais
repetidos de deslocamento químico nas regiões entre 127,4-133,3 ppm que determinam
presença de dois benzenos monosubstituído, pelo espetro de HMBC são observados
correlações entre o grupo carbonilo (166,0 ppm) e hidrogénios de um dos benzenos (8,08
ppm), sugerindo portanto a presença de um benzoilo (cinco insaturações). A existência de
sinais de δ de 13C entre 166,0 - 169,8 ppm e 1H entre 20,4 - 21,1 ppm, determinam presença
de 5 grupos acetatos (cinco insaturações). São também observados sinais de deslocamento
químico de 13C a 117,1 ppm de um carbono quarternário, muito característico a carbono de
nitrilos (CN) e um outro sinal em torno de 70 ppm de carbono alfa (CH oxigenado). Pelo
experimento HMBC (duas ou três ligações) nota-se correlações entre CN (117,1)/ H-alfa
(5,55) e pelo outro experimento HMQC nota-se correlações entre C-alfa (68,2)/ H-alfa
(5,55) confirmando a ligação -CH-CN, finalmente, pelo experimento HMBC visualiza-se
correlações entre o C-alfa (68,2) com hidrogénios do outro benzeno (7,45) em sobra,
confirmando então a presença do resíduo mandelonitrilo (seis insaturações).
Entre 106,5 e 98,7 ppm temos dois sinais de carbonos anoméricos (CH hemiacetálicos) que
indicam presença de duas unidades monosacáridas cíclicas (duas insaturações em falta), e
pelo experimento HMQC são visíveis correlações entre C-1 (106,5) Api /H-1(5,19) Api, e
C-1 (98,7) Glc/ H-1(4,52) Glc. O sinal de deslocamento de C-3 (83,7) Api é um valor
característico de um carbono quaternário de uma apiosa. Entretanto os sinais de C-3 (83,7)
Api e C-1 (106,5) Api confirmam a presença da estrutura de uma apiosa. O sinal de C-1
(98,7) justifica a presença da glucosa na estrutura.
53
Estes resíduos (Tabela 9) foram encontrados num composto (oxyanthin 5"benzoate), sem acetilar, descrito por Rockenbach et al. (1992), os seus espetros de RMN 1H
e de 13C foram obtidos utilizando-se CD3OD como solvente.
Os valores de deslocamento químico de RMN 1H e de 13C da glucose, apiosa e acetatos do
composto em análise, foram comparados com valores do resíduo6-O-D-apiofuranosil-β(16)-D-glucopiranosa peracetilada obtidos num composto isoflavónico por Mathias et
al.(1998), e estes valores são concordantes por se utilizar o mesmo solvente (CDCl3).
A ordem de união dos quatro fragmentos do composto, as posições e as estruturas de
piranosa em glucose (glucopiranose) e de furanosa em apiosa (apiofuranosa) foram
confirmadas através do experimento HMBC (Tabela 8).
Tabela 8. Experimento HMBC do composto 4
Fragmento
13
C
1
H
Glucose
C-1 (98,7)
H-7 (5,55) Mn
Glucose
C-1 (98,7)
H-5 (3,65) Glc
Apiosa
C-1 (106,5)
H-6 (3,65) Glc
Apiosa
C-1 (106,5)
H-4 (4,22; 4,36) Api
Benzoilo
C-7 (166,0)
H-5 (4,92) Api
A constante de acoplamento J= 7,6 de H-1Glc indica que é um doblete trans-diaxial
com H-2 Glc o que supõe uma configuração axial e a ligação glicosídica com o
mandenotrilo é β.
Figura 38. Estrutura do composto 4.
54
O composto 4 (desacetilado) já foi descritos por Rockenbach et al. (1992) e foi
isolado de diferentes órgãos (flores, frutos e caule) de P. livida.
Mistura de compostos 4 e 5 (Figura 39), sólido branco em forma de precipitado,
solúvel em diclorometano. Compostos 4 e 5 são esterioisómeros (5 epímero de 4) e foram
confirmados a partir do seu espetro de RMN
13
C. Neste espectro verifica-se duplicação de
sinais de deslocamento químico, com maior evidência para C-8 do mandelonitrilo.
Presume-se que o composto 4 possui uma configuração R em C-7 por estar deslocada para
frequências mais baixas (5,55 ppm), em meio básico se produz a epimerização desta
posição, passando para a configuração S, fenómeno este observado no seu epímero 5, tendo
o sinal de H-7 Mn, se deslocado para 5,74 ppm. Segundo Rockenbach et al. (1992),
Nakamura et al. (2009) e Yang et al. (2012), este seria o método mais adequado para a
identificação da configuração de H-7 dos glicosil-(R)-mandelonitrilos.
Figura 39. Estrutura e configurações do composto 4 e seu epímero (composto 5).
O composto 6 (Figura 40) foi obtido como um sólido incolor, solúvel em
diclorometano. A sua fórmula molecular C37H47NO16 foi deduzida a partir do pico de ião
[M+NH4] + a m/z = 779,3230 no seu espetro de HRMS. Esta fórmula molecular sugere a
presença de quinze insaturações na sua estrutura. Os dados espectrais de RMN
13
C e 1H
deste composto (Tabela 10) são muito parecidos aos do composto 4 (Tabela 9) nos
resíduos de Mandelonitrilo, glucose e apiosa (com insaturações de quatro acetatos,
perfazem doze insaturações). O acetato em falta, deve-se ao facto do C-3 de apiosa aparecer
a 78,7 ppm, valor este que sugere que C-3 de apiosa está ligado ao grupo OH (Mathias et
al.,1998).
Portanto, fazendo o somatório de todos oxigénios dos acetatos e das unidades
monosacáridas e do grupo OH unido a C-3 da apiosa, perfazem catorze oxigénios, faltando
portanto dois oxigénios e três insaturações. Este composto carece do segundo resíduo de
55
benzoilo e em seu lugar aparecem 10 novos sinais em espetro de RMN
13
C: 168,1; 144,5;
144,0; 127,0; 112,2; 73,0; 40,4; 28,1; 23,6 e 12,3 ppm. Aparecem também novos sinais de
RMN de 1H a 6,81 t; 5,81 dd; 5,18 dd; 5,14 dd; 2,19 m; 1,79 s; 1,57 m e 1,24 s. Pelo espetro
DEPT nota-se que a 12,3 e 28,1 ppm localizam-se dois carbonos metílicos (-CH3), a 112,2,
40,4 e 23,6 ppm localizam-se três carbonos metilénicos (-CH2-), a 144,5 e 144,0 ppm
localizam-se dois carbonos monoprotonados oleofínicos (=CH-) e a 168,1; 127,0 e 73,0
ppm localizam-se três carbonos quarternários: carbonilo, oleofínico e ligado ao grupo OH
respetivamente (álcool terciário). Portanto as três insaturações deste resíduo correspondem
a um grupo carbonilo e duas ligações duplas. Analisados estes sinais (HMQC, HMBC e
NOESY), permitiram a construção do resíduo (E)-6-hidroxi-2,6-dimetil-2,7-octadienoilo
(Monoterpeno) (Tabela 10). Pelo experimento HMBC observam-se correlações entre o C-1
(168,1) do monoterpeno com H-5 (4,38; 4,25) da apiosa, confirmando então que o
composto em estudo está ligado a apiosa. Os sinais deste resíduo monoterpeno foram
comparados com sinais dum resíduo presente num composto (5"-O-menthiafolate de
seguiside), descrito por Zhong et al. (1999), sendo o único composto descrito na
bibliografia onde este monoterpeno está unido a apiosa.
Figura 40. Estrutura do composto 6.
Mistura de compostos 6 e 7 (Figura 41) sólido incolor, solúvel em diclorometano.
Compostos 6 e 7 são estereoisómeros (7 epímero de 6) e foram confirmados a partir do seu
espetro de RMN
13
C. A configuração destes compostos é o mesmo descrito para os
estereoisómeros 4 e 5 (Figura 39) . O composto 6 possue a configuração R (H-7 Mn; 5,48
ppm) e composto 7 com a configuração S (H-7 Mn: 5,70 ppm).
56
Figura 41. Estrutura e configuração do composto 6 e seu epímero (composto 7).
Composto 11 (Figura 42) sólido incolor, solúvel em diclorometano. O seu espetro
de HRMS exibiu um pico de ião [M+NH4] + a m/z = 748,2456, o qual foi deduzido para a
fórmula molecular C35H38O17. Comparando os dados de RMN 13C e de 1H deste composto
(Tabela 11) com os do composto 4 (Tabela 9), foram observadas várias semelhanças,
destacando-se portanto a ausência de sinais deslocamento químico do resíduo
mandelonitrilo. Aparecem sinais duplicados do sinal de carbonilo (CO) nas regiões entre
164-165 ppm, sendo assim sugere-se a presença de dois resíduos de benzoilo, um ligado a
glucose e outro ligado a apiosa.
Figura 42. Estrutura do composto 11.
Composto 12 (Figura 43) sólido incolor, solúvel em diclorometano. A fórmula
molecular C38H48O18 foi deduzida do pico de ião [M+NH4]
+
a m/z = 810,3172 no seu
espetro de HRMS. Os dados espectrais de RMN 13C e 1H deste composto (Tabela 11) são
totalmente iguais aos do composto 6 (Tabela 10) nos resíduos de (E)-6-hidroxi-2,6-dimetil2,7-octadienoilo (monoterpeno), glucose e apiosa, tendo em falta o mandelonitrilo e em sua
substituição aparecem sinais de benzoilo. A outra diferença está no C-3 da apiosa que
aparece a 84,0 ppm, sugerindo que C-3 está unido a um acetato.
57
Figura 43. Estrutura do composto 12.
Composto 13 (Figura 44), obtido como um sólido incolor, solúvel em
diclorometano. O seu espetro de HRMS exibiu um pico de ião [M+NH4]
+
a m/z =
821,3342, o qual deduzido, corresponde a fórmula molecular C39H49NO17. Os dados
espectrais de RMN
13
C e 1H deste composto (Tabela 10) são totalmente iguais aos do
composto 6 (Tabela 10), com exceção no valor de deslocamento químico de 13C do C-3 de
apiosa que observou-se a 83,8 ppm, sugerindo que este está unido a um acetato.
Figura 44. Estrutura do composto 13.
Composto 14 (Figura 45) é um sólido branco, solúvel em diclorometano. O seu
espetro de HRMS exibiu um pico de ião [M+NH4] + a m/z = 717,2501, o qual deduzido,
corresponde a fórmula molecular C34H41N2O15. Os dados espectrais de RMN 13C e 1H deste
composto (Tabela 9) são totalmente iguais aos do composto 4 (Tabela 9), com exceção no
valor C-3 de apiosa que observou-se a 78,7 ppm, sugerindo que este está unido a um grupo
OH.
58
Figura 45. Estrutura do composto 14.
Composto 15 (Figura 46) sólido incolor, solúvel em diclorometano. A sua fórmula
molecular C28H34O16 foi deduzida do pico de ião [M+NH4]
+
a m/z = 644,21768 no seu
espetro de HRMS. Seus dados de RMN 13C e 1H (Tabela 11) apresentam similaridade com
os do composto 11 (Tabela 11), destacando-se nos espetros de composto em estudo,
ausência de um resíduo benzoilo. Outra diferença no C-3 de apiosa que aparece a 78,7 ppm,
indicando que o C-3 de apiosa está ligado ao grupo OH.
Figura 46. Estrutura do composto 15.
O composto 16 (Figura 47), sólido incolor, solúvel em diclorometano. A sua
fórmula molecular C36H46O17 foi deduzida à partir do pico de ião [M+NH4]
768,3067 no seu espetro de HRMS. Os dados espetrais de RMN de
13
+
a m/z =
1
C e de H deste
composto (Tabela 12) são praticamente iguais aos do composto 12 (Tabela 12). A única
diferença entre estes dois compostos está no C-3 da apiosa do composto em análise, que
está ligado ao grupo OH.
59
Figura 47. Estrutura do composto 16.
O composto 17 (Figura 48), possuindo a fórmula molecular C29H39O15, deduzida à
partir do pico de ião [M+NH4] + a m/z = 655,2354 num espetro de HRMS duma mistura
contendo os compostos 6, 15, 16, 17 e outros dois desconhecidos. A partir da sua massa
exata (637 u.m.a) foi comparada com a massa exata do composto 15 (626 u.m.a), tendo se
feito uma relação entre estas massas e notou-se que há diferença de 11 unidades, esta
relação também existe entre os compostos 4 e 11, 12 e 13 e entre 6 e 16, e deve-se pela
substituição dos resíduo benzoilo pelo mandelonitrilo ou vice-versa. Portanto o composto
15 (Figura 46) tem na sua estrutura o resíduo benzoilo e logo, o composto 17 deve possuir
na sua estrutura o resíduo mandelonitrilo. Assim nos dados de RMN 13C e 1H do composto
15 (Tabela 11) ao substituir o resíduo benzoilo pelo mandelonitrilo, chegamos a estrutura
do composto 17.
Figura 48. Estrutura do composto 17.
A oxyanthina (composto 17 sem acetilar), já foi descrita por Rockenbach et al.
(1992) e foi isolado de diferentes órgãos (flores, frutos e caule) de P. livida.
60
Tabela 9. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 4 e 14 (CDCl3)
Composto 4
Fragmento
Mandelonitrilo
Glucose
Apiosa
Benzoilo
OCOCH3
OCOCH3
Posição do
carbono
13
Ca
1
Ha,b
Composto 14
13
Ca
1
Ha,b
*
-
1
132,6
-
2,6
127,4
7,45 (2H; m)
127,5
7,37 (2H; m)
3,5
128,5
7,45 (2H; m)
128,5
7,37 (2H; m)
4
130,1
7,45 (H; m)
130,2
7,37 (H; m)
7
68,2
5,55 (H; s)
68,4
5,46 (H; s)
8
117,1
-
1
98,7
4,52 (H; d; 7,6)
98,7
4, 56 (H; m)
2
71,0
5,08 (H; m)
71,0
4,91 (H, m)
3
72,5
5,08 (H; m)
72,5
5,05 (H, m)
4
68,6
4,92 (H; m)
68,6
5,05 (H, m)
5
6
74,1
66,3
3,65 (H; m)
A 3,65 (H; m)
B 3,65 (H; m)
73,7
66,5
3,59 (H; m)
A 3,69 (H; m)
B 3,59 (H; m)
*
-
1
106,5
5,19 (H; d)
107,3
5,13 (H, m)
2
76,1
5,48 (H; d)
78,5
5,14 (H; d)
3
4
83,7
72,8
78,7
74,3
5
63,9
A 4,36 (H; d; 10,8)
B 4,22 (H; d; 10,4)
A 4,92 (H; m)
B 4,92 (H; m)
A 4,02 (H; d; 9,6)
B 3,93 (H; d; 9,6)
A 4,57 (H; d; 12,0)
B 3,59 (H; m)
1
129,5
-
2,6
129,8
8,08 (2H; d; 7,2)
129,8
8,04 (2H; d; 6,4)
3,5
129,1
7,45 (2H; m)
129,1
7,45 (2H; m)
4
133,3
7,55 (H; m)
133,4
7,53 (H; m)
7
166,0
-
*
-
170,1
-
170,1
-
169,8
-
*
-
169,5
-
*
-
169,3
-
-
-
168,9
-
168,9
-
21,1
2,11 (3H; s)
20,7
2,11 (3H; s)
20,7
2,05 (3H; s)
20,6
1,96 (3H; s)
20,6
2,02 (3H; s)
20,5
1,91 (3H; s)
20,6
1,97 (3H; s)
20,4
1,90 (3H; s)
20,5
1,95 (3H; s)
-
-
68,0
*
-
a
Deslocamento químico, δ, em ppm. b (Número de H, multiplicidade , constante de acoplamento, J, em Hz).
* Valor de sinal não registado (existência de menor quantidade de mostra).
61
Tabela 10. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 6 e 13 em CDCl3
Composto 6
Fragmento
Mandelonitrilo
Posição do
carbono
1
2,6
3,5
4
7
8
1
2
3
4
5
6
13
Ca
1
H a, b
Composto 13
13
Ca
1
H a, b
132,5
127,5
129,2
130,3
68,4
117,1
98,7
71,0
73,7
68,6
74,2
67,3
132,6 7,40 (2H; m)
127,0 7,44 (2H; m)
7,40 (2H; m)
129,2 7,44 (2H; m)
7,40 (H; m)
130,2 7,44 (H; m)
5,48 (H; s)
68,2 5,58 (H; s)
117,2 Glucose
4,60 (H; d; 8,0)
98,6 4,51 (H; d; 8,0)
4,92 (H; m)
70,9 4,94 (H; m)
4,92 (H; m)
72,8 4,94 (H; m)
4,92 (H; m)
68,6 4,59 (H; m)
3,58 (H; m)
74,1 3,64 (H; m)
A 3,67 (H; d; 9,6)
66,3 A 3,64 (H; m)
B 3,58 (H; m)
B 3,64 (H; m)
Apiosa
1
107,3 5,04 (H; m)
106,4 5,15 (H; d)
2
76,7 5,09 (H; m)
76,2 5,39 (H; d)
3
78,7 83,8 4
72,5 A 3,86 (H; d)
68,6 A 4,25 (H; d)
B 3,67 (H; d; 9,6)
B 4,16 (H; d; 10,0)
5
66,4 A 4,38 (H; d; 11,6)
63,4 A 4,73 (H; m)
B 4,25 (H; d; 12,0)
B 4,73 (H; m)
Monoterpeno
1
168,1 169,4 2
127,0 127,6 3
144,5 6,81 (1H; t)
145,4 6,82 (1H; t)
4
23,6 2,19 (2H; m)
25,1 2,21 (2H; m)
5
40,4 1,57 (2H; m)
40,4 1,65 (2H; m)
6
73,0 73,0 7
144,0 5,81 (H; dd; 17,2; 10,8)
144,5 5,85 (H; dd; 17,2; 10,8)
8
112,2 A 5,18 (H; dd; 17,2; 1,4)
112,2 A 5,22 (H; dd; 17,2; 1,4)
B 5,14 (H; dd; 10,8; 1,4)
B 5,04 (H; dd; 10,8; 1,4)
9
12,3 1,79 (3H; s)
12,3 1,84 (3H; s)
10
28,1 1,24 (3H; s)
28,1 1,30 (3H; s)
OCOCH3
170,4 170,3 170,2 170,2 169,4 169,8 169,0 169,8 169,6 OCOCH3
20,8 2,11 (3H; s)
21,1 2,10 (3H; s)
20,6 1,97 (3H; s)
20,7 2,04 (3H; s)
20,6 1,92 (3H; s)
20,6 2,02 (3H; s)
20,5 1,90 (3H; s)
20,6 2,00 (3H; s)
20,5 1,98 (3H; s)
a
Deslocamento químico, δ, em ppm. b (Número de H, multiplicidade , constante de acoplamento, J, em Hz).
62
Tabela 11. Dados de RMN 13C e 1H dos compostos 11 e 15 em CDCl3
Composto 11
Fragmento
Benzoilo I
Glucose
Apiosa
Benzoilo II
OCOCH3
OCOCH3
a
Posição do
Carbono
13
H a, b
Composto 15
Ca
1
13
Ca
1
H a, b
1
133,0
-
130,1
-
2,6
129,9
7,91 (2H; dd; 8,0;1,0)
128,6
7,97 (2H; d; 6,8)
3,5
129,7
7,35 (2H; m)
128,5
7,42 (2H; m)
4
133,0
7,47 (H; m)
133,9
7,56 (H; m)
7
164,4
-
164,5
-
1
92,3
5,82 (H; d; 8,1)
92,3
5,82 (H; d; 8,0)
2
70,2
5,26 (H; d; 3,2)
70,2
5,25 (H; d; 3,6)
3
72,7
5,26 (H; d; 3,2)
74,1
5,25 (H; d; 3,6)
4
68,7
5,02 (H; m)
68,6
5,02 (H; m)
5
6
74,1
66,3
3, 84 (H; m)
A 3,69 (H; d)
B 3,60 (H; m)
74,3
66,2
3, 85 (H; m)
A 3,72 (H; d; 2,4)
B 3,50-3,59 (H; m)
1
106,1
5,00 (H; d)
107,2
5,00 (H; d)
2
76,3
5,40 (H; d)
76,7
4,91 (H; d)
3
4
83,9
72,6
78,7
72,7
5
63,6
A 4,30 (H; d; 10,4)
B 4,14 (H; d; 10,4)
A 4,95 (H; d; 12,0)
B 4,73 (H; d; 12,0)
A 3,92 (H; d)
B 3,79 (H; d; 10,0)
A 4,30 (H; d; 11,6)
B 4,15 (H; d; 12,0)
66,5
1
130,1
-
-
-
2,6
129,8
8,02 (2H; dd; 8,0; 1,3)
-
-
3,5
128,5
7,31-7,40 (2H; m)
-
-
4
133,7
7,47 (H; m)
-
-
7
165,9
-
-
-
170,1
-
171,2
-
169,7
-
170,1
-
169,4
-
169,9
-
169,3
-
169,4
-
169,0
-
169,3
-
21,1
1,99 (3H; s)
20,6
1,99 (3H; s)
20,7
2,02 (3H; s)
20,6
1,96 (3H; s)
20,6
2,00 (3H; s)
20,5
1,93 (3H; s)
20,6
1,97 (3H; s)
2,06 (3H; s)
20,4 1,91 (3H; s)
20,6 1,93 (3H; s)
Deslocamento químico,δ, em ppm. b (Número de H, multiplicidade , constante de acoplamento, J, em Hz).
63
Tabela 12. Dados de RMN de 13C e 1H dos compostos 12 e 16 em CDCl3
Composto 12
Fragmento
Benzoilo
Glucose
Apiosa
Monoterpeno
OCOCH3
Posição do
carbono
13
Ca
1
13
Ca
1
H a, b
1
130,2
-
130,1
-
2,6
129,2
7,94 (2H; dd; 7,2; 1,2)
128,6
7,96 (2H; dd; 7,2; 1,2)
3,5
128,6
7,40 (2H; m)
128,5
7,41 (2H; m)
4
133,8
7,52 (1H; m)
133,8
7,53 (1H; m)
7
164,4
-
1
92,3
5,81 (H; d)
92,3
5,81 (H; m)
2
70,2
5,26 (H; d; 4,0)
70,2
5,26 (H; m)
3
72,7
5,26 (H; d; 4,0)
72,7
5,26 (H; m)
4
68,7
5,04 (H; m)
68,7
5,00 (H; m)
5
6
74,1
66,2
3, 83 (H; m)
A 3,64 (H; d)
B 3,58 (H; m)
74,1
67,2
3, 92 (H; m)
A 3,71 (H; m)
B 3,54 (H; m)
1
106,0
4,88 (H; d)
107,3
5,26 (H; m)
2
76,3
5,27 (H; d)
76,4
5,04 (H; m)
3
4
84,0
72,5
78,8
72,7
5
63,0
A 4,21 (H; d; 10,8)
B 4,08 (H; d; 10,8)
A 4,75 (H; d; 12,4)
B 4,49 (H; d; 12,8)
A 3,93 (H; d; 9,6)
B 3,83 (H; d; 10,0)
A 4,32 (H; d; 12,0)
B 4,22 (H; d; 12,0)
1
169,1
-
169,3
2
127,0
-
3
144,6
6,79 (H; t)
144,5
6,79 (H; t)
4
23,5
2,08 (2H; m)
23,5
2,17 (2H; m)
5
40,5
1,60 (2H; m)
40,5
1,63 (2H; m)
6
73,0
-
73,5
-
7
8
143,4
112,1
5,88 (H; dd; 17,2; 10,8)
A 5,17 (H; dd; 17,2; 1,4)
B 5,02 (H; dd; 10,8; 1,4)
143,8
112,1
5,86 (H; dd; 17,2; 10,8)
A 5,16 (H; dd; 17,2; 1,4)
B 5,02 (H; dd; 10,8; 1,4)
9
12,3
1,75 (3H; s)
12,2
1,90 (3H; s)
10
28,1
1,25 (3H; s)
28,0
1,58 (3H; s)
170,2
-
170,1
-
169,6
-
168,1
-
169,5
-
-
169,4
-
-
169,4
-
21,1
2,00 (3H; s)
20,7
1,98 (3H; s)
20,8
2,00 (3H; s)
20,6
1,98 (3H; s)
20,6
1,99 (3H; s)
20,6
1,97 (3H; s)
20,5
1,92 (3H; s)
OCOCH3
a
H a, b
Composto 16
Deslocamento químico,δ, em ppm.
b
-
66,3
-
-
2,05 (3H; s)
1,94 (3H; s)
(Número de H, multiplicidade , constante de acoplamento, J, em Hz).
64
4.2.3. Composto 10
O composto 10 (Figura 49) é proveniente de frações donde foram isolados os
dissacáridos. Como os dissacáridos, o seu isolamento foi por meio de cromatografia
preparativa em TLC (PTLC). Este composto foi caraterizado por duas técnicas: RMN e
cromatografia gasosa acoplada a espetroscopia de massa (GC/MS).
Figura 49. Estrutura de D-glucitol isolado das folhas de P. locuples.
4.2.3.1.
Elucidação estrutural
O composto 10 foi isolado como um sólido branco, solúvel em diclorometano. O
seu espetro de HRMS exibiu um pico de ião [M+NH4] + a m/z = 424,1822, o qual deduzido,
corresponde a fórmula molecular C17H30NO11. Pelo espectro de RMN 1H deste composto
são observados dois sinais de deslocamento químico (δ) a 3,48 (dd; 3,6; H-6) e a 4,05 (dd;
1,6; 5,2; H-2) correspondentes a hidrogénios metilénicos e quatro sinais de δ a 3,33 (m; H1), 4,21 (d; 2,8; H-3), 5,06 (m; H-4) e a 5,45 (m; H-5) referentes a hidrogénios
monoprotonados, também observa-se um sinal a 3,30 ppm, correspondente ao grupo metoxi
(O-CH3). No espetro de RMN 13C são observados cinco sinais de δ entre 170,5-171,4 ppm
correspondentes a carbonos carbonilos (CO), sugerindo portanto a presença de acetatos. A
presença de cinco sinais de carbonos metílicos (-CH3) em 21,7-21,4 ppm, também
fundamentam a existência destes acetatos e pelo experimento HMBC observam-se
correlações entre CO (170,5 ppm) com os hidrogénios metílicos (2,04; s). Este composto
foi confirmado pela técnica de GC/MS como sendo o penta-O-acetil-1-O-metil-D-glucitol.
65
Tabela 13. Dados de RMN de 13C e 1H do composto 10 em CDCl3
Ha, b
13
1
71,5
4,05 (2H; dd; 1,6; 5,2)
2
60,0
3,33 (H; m)
3
68,1
4,21 (H; d; 2,8)
4
68,4
5,06 (H; m)
5
68,6
5,45 (H, m)
6
62,7
3,48 (2H; dd; 3,6)
OCH3
60,2
3,30 (3H; s)
OCOCH3
171,4
-
170,8
-
170,7
-
170,5
-
170,5
-
21,7
2,07 (3H; s)
21,6
2,06 (3H; s)
21,5
2,04 (3H; s)
21,4
2,03 (3H; s)
21,4
2,02 (3H; s)
OCOCH3
a
Ca
Número de carbono
1
Deslocamento químico,δ, em ppm. b (Número de H, multiplicidade , constante de acoplamento, J, em Hz).
4.2.3.2.
Análise por GC/MS
Na análise do composto 10 por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massa, foi possível obter um cromatograma contendo um pico com o respetivo tempo de
retenção. Este composto foi identificado por comparação do espetro de massas obtido com
o espetro de massas existente na base de dados do equipamento utilizado. Portanto, foi
possível observar no cromatograma um pico com o tempo de retenção de 12,646 minutos
(Figura 50).
66
Figura 50. Cromatograma do composto 10 analisado por GC/MS.
O espetro de massas por impacto de eletrão (Figura 51) do composto 10 mostrou
uma razão em m/z 406, que corresponde ao pico do ião molecular do penta-O-acetil-1-Ometil-D-glucitol.
67
Figura 51. Espetro de massa de penta-O-acetil-1-O-metil-Dglucitol.
4.2.4. Análise de geninas por GC/MS
Na análise das geninas por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massa, foi possível obter cromatogramas contendo picos com diferentes tempos de
retenção. Os compostos presentes foram identificados por comparação entre os espetros de
massas obtidos com os espetros de massas existentes na base de dados do equipamento
utilizado. No entanto, foi possível observar no cromatograma (Figura 52) três picos com os
seguintes tempos de retenção: 4,662; 7,450 e 11,720 min, entretanto só foram identificados
os compostos dos primeiros dois picos.
68
Figura 52. Cromatograma das geninas analisadas por GC/MS.
O espetro de massas por impacto de eletrão (Figura 53) do composto 18, mostrou
uma razão em m/z 106, que corresponde ao pico do ião molecular do benzaldeido.
Figura 53. Espetro de massa do benzaldeido.
69
O espetro de massas por impacto de eletrão (Figura 54) do composto 1, mostrou
uma razão em m/z 122, que corresponde ao pico do ião molecular do ácido benzóico
(composto 1).
Figura 54. Espetro de massa do ácido benzóico.
4.3. Bioatividade
4.3.1. Atividade antioxidante
Os resultados da atividade antioxidante dos extratos e frações preparados a partir de
folhas trituradas de P. locuples são apresentados na Tabela 14.
70
Tabela 14. Atividade antioxidade de extratos/frações de P. locuples (média± SD)
Amostras
Valores de EC50 (mg/mL)
Atividade captadora de DPPH
Ext.Hex
7,69 ± 0,23
Poder Redutor
(PR)
1,17 ± 0,01
Inibição da descoloração
do β-Caroteno
3,40 ± 0,06
Ext.DCM
4,28 ± 0,13
1,55 ± 0,00
2,21 ± 0,08
Ext.MeOH
0,29 ± 0,01
0,31 ± 0,00
0,52 ± 0,01
Ext.H2O
0,32 ± 0,01
0,30 ± 0,01
0,31 ± 0,00
F.MeOHsol.AcOEt
0,48 ± 0,01
0,48 ± 0,02
0,88 ± 0,02
F.MeOHsol.But
> 10
> 10
10,66 ± 0,41
F.MeOHsol.H2O
0,59 ± 0,01
0,50 ± 0,01
1,01 ± 0,02
Ext.AcOEt
2,79 ± 0,07
2,17 ± 0,00
7,57 ± 0,34
Ext.AcOEt acetilado
> 20
1,81 ± 0,03
10,72 ± 0,12
Geninas Ext.AcOEt
3,37 ± 0,06
1,59 ± 0,01
2,21 ± 0,06
Controlo Positivo
(Trolox)
42,0 µg/mL
41,0 µg/mL
18,0µg/mL
De uma forma geral, os extratos obtidos com solventes de maior polaridade
(metanol e água) revelaram maior atividade antioxidante (EC50DPPH = 0,29 e 0,32 mg/mL,
respetivamente; EC50PR = 0,31 e 0,30 mg/mL, respetivamente; EC50β-caroteno = 0,52 e
0,31 mg/mL, respetivamente). Os extratos obtidos a partir da partição do extrato metanólico
com acetato de etilo e água apresentaram valores intermédios de atividade antioxidante,
com exceção do ensaio de inibição da descoloração do β-caroteno que originou EC50 = 0,88
e 1,01 mg/mL, respetivamente, enquanto que os extratos obtidos com hexano,
diclorometano e acetato de etilo (normal e acetilado), bem como as geninas, apresentaram
menor potencial antioxidante. Até à concentração máxima testada (10 mg/mL), o extrato
metanólico particionado com n-butanol não apresentou nem atividade captadora de DPPH,
nem PR; o EC50 obtido no ensaio de descoloração do β-caroteno foi superior a 10 mg/mL
(EC50β-caroteno = 10,66 mg/mL).
71
4.3.2. Atividade antitumoral e citotoxicidade
4.3.2.1.
Extratos/frações de folhas de P. locuples
Relativamente aos ensaios de citotoxicidade em linhas celulares tumorais, todos os
extratos revelaram atividade inibitória do seu crescimento, exceto os extratos metanólicos
particionados em n-butanol e água (GI50> 400 µg/mL) na linha NCI-H460. O extrato de
acetato de etilo acetilado (Ext.AcOEtacetilado) foi o que apresentou maior atividade em
todas as linhas celulares testadas (79,61µg/mL<GI50<218,61µg/mL). Somente a fração
metanólica solúvel em acetato de etilo (F.MeOHsol.AcOEt) revelou toxicidade nas células
não-tumorais PLP2 (GI50= 325,58 µg/mL), mas a uma concentração superior à que revelou
atividade para linhas tumorais (Tabela 15).
Tabela 15. Atividade antitumoral de extratos/frações de folhas de P. locuples (média±SD)
GI50 (µg/mL)
Amostras
HeLa
HepG2
MCF-7
NCI-H460
PLP2
Ext.Hex
223,52±19,08
357,09±5,53
273,70±5,80
331,09±20,65
>400
Ext.DCM
185,76±13,63
306.94±7.41
200,48±14,73
269.69±8.47
>400
Ext.MeOH
265,79±0,63
332,72±17,67
245,10±22,94
269,26±11,92
>400
Ext.H2O
274,71±0,30
349,22±10,85
251,38±18,72
268,23±8,97
>400
F.MeOHsol.AcOEt
100,27±6,90
290,96±4,04
196,76±9,99
210,93±14,58
>325,58±12,36
F.MeOHsol.But
283,56±22,38
377,95±8,17
368,70±3,27
>400
>400
F.MeOHsol.H2O
304,48±4,59
372,02±5,39
269,11±8,66
>400
>400
Ext.AcOEt
203,92±11,98
245,38±15,75
186,76±4,42
276,51±10,46
>400
Ext.AcOEt acetilado
80,64±5,69
129,13±3,36
79,61±0,14
218,61±19,46
>400
GeninasExt.AcOEt
170,56±3,84
275,94±17,42
219,71±11,35
256,05±10,41
>400
0,91±0,11
1,10±0,09
1,21±0,02
1,03±0,09
2,29±0,18
Controlo Positivo
(Elipticina)
72
4.3.2.2.
Compostos isolados
No geral, todos os compostos isolados da fração metanólica solúvel em acetato de
etilo (F.MeOHsol.AcOEt) e do extrato de acetato de etilo acetilado (Ext.AcOEtacetilado)
revelaram atividade inibitória do crescimento de todas as linhas celulares tumorais testadas,
mas também revelaram toxicidade nas PLP2 (Tabela 16). Todos os compostos
apresentaram bons resultados inibitórios do crescimento celular da linha de carcinoma
cervical (HeLa, 9,68µg/mL<GI50<67,00µg/mL) com a exceção do composto 8 que teve um
GI50= 177,74 µg/mL. A mistura dos triterpenos 2, 3 e o triterpeno 9 foram os mais potentes
contra todas as linhas celulares (4,51µg/mL<GI50<32,50µg/mL), e em contrapartida foram
os mais tóxicos (para células não-tumorais, PLP2) de todos os compostos com GI50= 27,77
e 13,02 µg/mL, respetivamente. Entre os dissacáridos, o 15 apresentou bons resultados
inibitórios
do
crescimento
de
todas
as
linhas
celulares
testadas
(9,68µg/mL<GI50<34,52µg/mL, com a exceção da linha de carcinoma do pulmão (NCIH460, GI50= 102,28 µg/mL). Para além da linha celular de carcinoma cervical (HeLa), os
dissacáridos 12, 13 e 14, também apresentaram bons resultados inibitórios do crescimento
da linha celular de carcinoma hepatocelular ( HepG2, GI50= 68,60; 9,95 e 28,20 µg/mL,
respetivamente); os mesmos compostos 12 e 13, voltaram a apresentar bons resultados
inibitórios do crescimento da linha celular de carcinoma de pulmão (NCI-H460, GI50=
81,30 e 61,40 µg/mL, respetivamente). Os menos potentes contra todas as linhas celulares
testadas foram os compostos 8 e 11 (66,37µg/mL<GI50<324,4µg/mL). O dissacárido 4 foi
apenas menos potente contra as linhas celulares de carcinoma de mama e pulmão (MCF-7,
GI50= 200,39µg/mL e NCI-H460, GI50= 244,09 µg/mL).
73
Tabela 16. Atividade antitumoral de compostos isolados (média±SD)
GI50 (µg/mL)
Amostras
HeLa
HepG2
MCF-7
NCI-H460
PLP2
2, 3*
11,33±1,22
22,92±0,11
23,04±0,04
10,58±1,49
27,77±2,05
4
67,00±5,71
85,24±7,23
200,39±4,34
244,09±9,58
233,79±17,99
4, 5**
63,84±3,49
167,23±4,49
97,42±7,19
199,69±8,29
237,06±8,65
6
42,21±1,05
119,35±6,97
99,60±3,15
233,43±12,34
267,65±2,52
6, 7**
24,43±0,78
287,60±2,37
94,56±5,81
82,62±1,65
214,00±10,20
8
177,74±11.33
196,26±15.61
219,30±20.30
228,16±11.89
200,67±0,81
9
31,50±3,04
15,12±1,26
32,50±0,31
4,51±0,49
13,02±0,53
10
44,03±1,14
120,01±10,85
147,55±11,97
52,24±3,25
>225
11
66,37±5,71
322,65±1,66
274,46±1,47
324,41±12,26
343,89±5,20
12
58,22±3,94
68,60±3,98
242,64±15,13
81,30±7,62
247,63±22,10
13
34,09±1,66
91,87±7,45
110,70±9,33
61,40±6,23
126,11±3,62
14
39,50±0,24
9,95±0,04
98,00±6,47
135,53±3,63
155,48±4,09
15
9,68±0,80
28,20±0,57
34,52±3,39
102,28±5,20
131,28±2,32
1,10±0,09
1,21±0,02
1,03±0,09
2,29±0,18
Controlo Positivo 0,91±0,11
(Elipticina)
* Mistura
** Mistura de estereoisómeros
Os melhores resultados observados para a mistura dos triterpenos 2,3 e triterpeno 9
na inibição do crescimento de todas as linhas celulares testadas, podem estar relacionados
com a presença do grupo OH na estrutura desses compostos. Os compostos 8 e 9 foram
acetilados nos grupos OH do C-3, mas o composto 9 possui um grupo OH no C-11 que não
sofreu acetilação. Estes resultados não são surpreendentes, já que existem vários estudos
sobre propriedades antitumorais comprovadas de triterpenos pentacíclicos (Mazumder et
al., 2013).
Para os dissacáridos 4 e 11, nota-se que a presença do mandelonitrilo no composto
4, potencia a atividade antitumoral deste composto, com exceção na linha celular HeLa,
onde o composto 11 apresenta melhor resultado. O mesmo se verifica para os dissacáridos
12 e 13.
Entre a mistura dos dissacáridos 4,5 e o dissacárido 4, observa-se que a mistura
apresenta melhores resultados antitumorais, com a exceção da linha celular HepG2, em que
74
o composto 4 apresentou bom resultado. Estes dados podem estar relacionados com a
presença do seu epímero (composto 5) na mistura que pode estar a potenciar a atividade
antitumoral do composto 4. A mesma observação pode ser feita para a mistura dos
dissacáridos 6 e 7, em comparação com o dissacárido 7.
Segundo os resultados do dissacárido 15, pode afirmar-se que a não acetilação do C3 da apiosa, torna os compostos mais potentes na inibição do crescimento celular das linhas
celulares tumorais. O mesmo fenómeno se observa nos compostos 4 e 14, onde o composto
14 foi mais potente em relação ao 4. Este fenómeno não se observa entre os compostos 6 e
13; o composto 6 não está acetilado no C-3 da apiosa, e entretanto apresenta maus
resultados quando comparado com o 13 que está acetilado no C-3 da apiosa.
75
5. CONCLUSÕES
Foram preparados diferentes extratos e frações de folhas moídas de Psydrax
locuples nomeadamente, extratos de hexano, diclorometano, acetato de etilo, metanol e
água, e frações metanólicas solúveis em acetato de etilo, n-butanol e água.
Por extração ácido-base da fração metanólica solúvel em acetato de etilo foi obtida
a fração neutra e, numa das suas frações acetiladas, foram isoladas uma mistura de dois
triterpenos e duas misturas de dissacáridos cianogénicos com seus respetivos epímeros
(artefactos).
No extrato de acetato de etilo acetilado foram isolados dois triterpenos acetilados
que foram posteriormente esterificados com trimetilsilildiazometano produzindo, portanto,
os seus respetivos ésteres. Para além dos triterpenos, foram também isolados nove
dissacáridos dos quais cinco são cianogénicos.
Até então, o ácido 11β-hidroxiursólico e os seus dois derivados eram compostos
triterpénicos desconhecidos. Em relação aos dissacáridos, apenas dois compostos
relacionados com os identificados, tinham sido descritos anteriormente.
Os extratos, frações e compostos isolados foram submetidos aos ensaios de
bioatividade. Todos os extratos revelaram atividade antioxidante, no entanto, os extratos
metanólico e aquoso apresentaram melhores atividades. O extrato de acetato de etilo
acetilado apresentou melhor atividade antitumoral e não apresentou toxicidade nas PLP2
(células não-tumorais).
Os compostos isolados apresentaram bons resultados de atividade antitumoral, mas
apresentaram também toxicidade para as PLP2. Os melhores resultados foram obtidos com
os triterpenos pentacíclicos 2,3 (mistura) e 9. Os dissacáridos 12, 13, 14 e 15 mostraram
também serem possuidores de boa atividade em inibir algumas linhas celulares.
Os resultados dos ensaios de bioatividade dos extratos e de compostos isolados vêm
realçar o potencial medicinal das folhas de P. locuples tão utilizadas na medicina
tradicional em Moçambique. Para além dos triterpenos que possuem atividade antitumoral
76
comprovada, pode afirmar-se que os dissacáridos isolados podem ser potenciais candidatos
para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento do cancro.
77
BIBLIOGRAFIA
Abreu, R. M., Ferreira, I. C., Calhelha, R. C., Lima, R. T., Vasconcelos, M. H., Adega, F.,
et al. (2011). Anti-hepatocellular Carcinoma Activity Using Human HepG2 Cells and
Hepatotoxicity of
6-
Substituted
Methyl
3-Aminothieno
[3,2-b]pyridine-2-
carboxylate derivatives: In Vitro Evaluation, Cell Cyclo Analysis and QSAR Studies.
European Journal of Medicinal Chemistry 46, 5800-5806.
Akomo, E. F., Zongo, C., Karou, S. D., Obame, L. C., Savadogo, A., Atteke, C., et al.
(2009). In vitro Antiplasmodial and Antibacterial Activuties of Canthium multiflorum
Schum and Thonn (Rubiacea) Extracts. Pakistan Journal of Biogical 12, 919-923.
Awah, F. M., Uzoegwu, P. N., Ifeonu, P., Oyugi, J. O., Rutherford, J., Yao, X., et al.
(2012). Free Radical Scavenging Activity, Phenolic Contents and Cytotoxicity of
Selected Nigerian Medicinal Plants. Food Chemistry 131, 1279-1286.
Bero, J., Beaufay, C., Hanaert, V., Herent, M. -F., Michels, P. A., & Quetin-Leclercq, J.
(2013). Antitrypanosomal Compounds from the Essencial Oil and Extracts of Keetia
leucantha. Phytomedicine 20, 270-274.
Bero, J., Ganfon, H., Jonville, M.-C., Frederich, M., Gbaguidi, F., DeMol, P., et al. (2009).
In Vitro Antiplasmodial Activity of Plantas Used in Benin in Tradicional Medicine to
Treat Malaria. Journal of Ethnopharmacology 122, 439-444.
Bero, J., Hannaert, V., Chataigne, G., Herent, M.-F., & Quetin-Leclercq, J. (2011). In Vitro
Antitrypanosomal and Antileishmanial Activity of Plants Used in Benin in
Tradicional Medicine and Bio-guided Fractionation of the Most Active Extract.
Journal of Ethnopharmacology 137, 998-1002.
Bhan, S., Kumar, R., Kalla, A. K., & Dhar, K. L. (1988). Triterpenoides from Swetia
Petiolata. Phytochemistry 27, 539-542.
78
Brimer, L., Christensen, B. S., Molgaard, P., & Nartey, F. (1983). Determination of
Cyanogenic Compounds by Thin-Layer Chromatography.1. A Densitometric Method
for Quantification of Cyanogenic Glycosides, Employing Enzyme Preparations (BGlucoronidase ) from Helix pomatia and Picrate Impregneted Ion-Exchange Sheets.
Journal of Agricultural and Food Chemistry 31, 789-793.
Chase, M. W., & Reveal, J. L. (2009). A phylogenetic classification of the land plants to
accompany APG IIIboj_1002 1. Botanical Journal of the Linnean Society 161, 122127.
Coelho, V. P., Agra, M. d., & Barbosa, M. R. (2006). Estudo Farmacobotânico das Folhas
de Tocoyena formosa (Cham. & Schltdl.) K.Schum. (Rubiaceae). Revista Brasileira
de Farmacognosia 16, 170-177.
Coulibaly, M. T., Zieglera, H. L., Olsen, C. E., Hassanata, M. k., Pierre, G. I., Nacoulma,
O.
G.,
et
al.
(2009).
19a-Hydroxy-3-oxo-ursa-1,12-dien-28-oic
acid,
an
Antiplasmodial. Natural Product Research 23, 1108-1111.
Da Silva, M. C., Izidine, S., & Amude, A. B. (2004). A preliminary checklist of the
vascular plants of Mozambique. Pretoria: Southern African Botanical Diversity
Network Report No. 30. SABONET.
David, & Nichols, S. J. (2002). Gardening with Indigenous Shrubs (1st ed.). (M. whiterkor,
Ed.) Cape Town: Struik Publishers.
De Araujo, F. C., Marques, F. G., da Silva, C. C., Santin, S. M., Nakamura, C. V., &
Zamuner, M. L. (2009). Terpenos isolados de Coussarea platyphylla Müll. Arg.
(Rubiaceae). Quim. Nova 32, 1760-1763.
Del Fresno, A. M., Benito, P. B., & Accame, M. E. (1999). Farmacognosia, conceptos
Generales. In A. M. del Fresno, & F. A. M Villar del (Ed.), Farmacognosia
General.Madrid: Editorial Sinteses.
GBIF. (2000). JSTOR | Global Plants: Psydrax locuples. (ITHAKA, Editor) Obtido em 06
de Janeiro de 2014, de plants.jstor.org/taxon/psydrax.locuples.
79
GBIF. (s.d). Psydrax locuples - Gwannon.com. Obtido em 11 de January de 2014, de
www.gwannon.com/species/Psydrax-locuples.
Germishuizen, G., & Meyer, N. L. (Edits.). (2003). Plants of southern Africa: an annotated
checklist (Vol. Strelitzia 14). Pretoria: National Botanical Institute,.
Guimaraes, R., Barros, L., Duenas, M., Calhelha, R. C., Carvalho, A. M., Santos-Buelga,
C., et al. (2013). Infusion and Decoction of Wild German Chamimile: Bioactive and
Characterization of Organic Acids and Phenolic Compounds. Food. Chemistry 136,
947-954.
Gunasegaran, R., Subramani, K., Parimala, P. A., Nair, A. G., Rodriguez, B., &
Madhusudanan, K. P. (2001). 7-O-(6-O-Benzoyl-D-glucopyranosyl) -Rutin from
Leaves of Canthium dicoccum. Fitoterapia 72, 201-205.
Hashimoto, N., Aoyawa, T., & Shioiri, T. (1981). New Methods and Reagents in Organic
Synthesis.
A
Simple
Efficient
Preparation
of
Methyl
Esters
with
Trimethylsilyldiazomethane and its Aplication to Gas Chromatographic Analysis of
Fatty Acids . Chemical Pharmaceutical Buletin 29, 1475-8.
He, X., Liu, D., & Liu, R. H. (2008). Sodium Borohydride/Chloranil-Based Assay for
Quantifying Total Flavonoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56, 9337–
9344.
Heinrich, M., Barnes, J., Gibbons, S., & Williamson, E. M. (2004). Fundamentals of
Pharmacognosy and Phytotherapy. (C. Livingstone, Ed.) Toronto: Elservier.
Herath, W. H., Sultanbawa, M. U., Wannigama, G. P., & Cave, A. (1979). Alkaloidal and
Other Constituents of Uncaria elliptica and Canthium Dicoccum. Phytochemistry 18,
1385-1387.
Hostettmann, K., Gupta, M. P., Marston, A., & Queiroz, E. F. (2008). Handbook of
Strategies for the Isolation of Bioactive Natural Products (1st Edition ed.). Bogota:
SECAB and CYTED.
80
Hyde, M., Wursten, B., Ballings, P., Dondeyne, S., & Palgrave, M. C. (2007). Flora of
Mozambique: Genus page: Psydrax. Obtido em 05 de janeiro de 2014, de
http://www.mozambiqueflora.com/speciesdata/genus.php?genus_id=1401.
IIboudo, D. P., Basilico, N., Parapini, S., & Corbett, Y. (2013). Antiplasmodial and Antiinflammatory activities of Canthium Henriquesianum (K. Schum), a Plant Used in
Tradicional Medicine in Burkina Faso. Journal of Ethnopharmacology 148, 763-769.
Jose, B., Jirovetz, L., & Shafi, P. M. (2008). Phytochemical Studies on the Thorns and
Leaves of Canthium parviflorum Lam. Asian Journal of Chemistry 20, 5372-5376.
Kanchanapoom, T., Kasai, R., & Yamasaki, K. (2002). Iridoides and Phenolic Glycosides
from Canthium berberidifolium. Phytochemistry 61, 461-464.
Kone, W. M., Atindehou, K. K., Terreux, C., Hostettmann, K., Traore, D., & Dosso, M.
(2004). Tradicional Medicine in North Cote-d' Ivoire: Screening of 50 Medicinal
Plantas for Antibacterial Activity. Journal of Ethnopharmacology 93, 43-49.
Kouam, S. F., Ngouonpe, A. W., Bullach, A., Lamshöft, M., Kuigoua, G. M., & Spiteller,
M. (2013). Monoterpenes with antibacterial activities from a Cameroonian medicinal
plant Canthium multiflorum (Rubiaceae). Fitoterapia 91, 199–204.
Lagnika, L., Anago, E., & Sanni, A. (2011). Screening for Antibacterial, Antioxidant
Activity and Toxicity of Some Medicinal Plants in Benin Folkloric Medicine. Journal
of Medicinal Plants Reseach 5, 773-777.
Lima, F. V., Malheiros, A., Otuki, M. F., Calixto, J. B., Yunes, R. A., Filho, V. C., et al.
(2005). Three New Triterpenes from the Resinous Bark of Protium kleinii and their
Antinociceptive Activity. Journal of Brazilian Chemical Society 16, 578-582.
Lobo, A. M., & Lourenco, A. M. (2007). Metodos de Estudo Biossintético. In A. M. Lobo,
& I. Press (Ed.), Biossíntese de Produtos Naturais. Lisboa.
Mathias, L., Vieira, I. J., Braz-Filho, R., & Rodrigues-Filho, E. (1998). A New Isoflavone
Glycoside from Dalbergia nigra. Journal of Natural Products 61, 1158-1161.
81
Mazumder, K., Tanaka, K., & Fukase, K. (2013). Cytotoxic Activity of Ursolic Acid
Derivatives Obtained by Isolation and Oxidative Derivatization. Molecules 18, 89298944.
Musila, M. F., Dossaji, S. F., Nguta, J. M., Lukhoba, C. W., & Munyao, J. M. (2013). In
vivo Antimalarial Activity,toxicity and Phytochemical Screening of Selected
Antimalarial plants. Journal of Ethnopharmacology 146, 557-561.
Nakamura, S., Wanga, Z., Xu, F., Matsuda, H., Wub, L., & Yoshikawa, M. (2009). The
Absolute Stereostructures of Cyanogenic Glycosides, Hydracyanosides A, B, and C,
from the leaves and stems of Hydrangea macrophylla. Tetrahedron Letters 50, 4639–
4642.
Pasumarthi, S., Chimata, M. K., Chetty, C. S., & Challa, S. (2011). Screening of
Phytochemical Compouds in Selected Medicinal plantas of Deccan Plateau and their
Viability Effcts on Caco-2 Cells. Journal of Medicinal Plants Reseach 5, 6955-6962.
Pone, J. W., Mbida, M., & Bilong, C. F. (2009). In Vivo Evaluation of Potential
nematicidal Properties of Ethanol Extract of Canthium manni (Rubiaceae) on
Heligmossomoides polygyrus Parasite of Rodentes. Veterinary Parasitoloy 166, 103107.
Psydrax locuples (K.Schum.) Bridson — The Plant List.(2010). Obtido em 29 de November
de 2013, de www.theplantlist.org/tpl/record/kew-170255.
Rockenbach, J., Nahrstedt, A., & Wray, V. (1992). Cyanogenic Glycosides from Psydrax
and Oxyanthus Spacies. Phytochemistry 31, 567-570.
Rodrigues, A. G., & Amaral, A. C. (2012). Plantas Medicinais e Fitoterapia na Saúde da
Família. In Práticas Integrativas e Complementares (1ª edição ed., pp. 13-21).
Brasilia: Ministerio de Saude.
Schwarz, B., Wray, V., & Proksch, P. (1996). A Cyanogenic Glycoside from Canthium
schimperianum. Phytochemistry 3, 633-636.
82
Senkoro, A., Barbosa, F., DA Silva, A. F., Manjate, A., Samuel, V. M., Maquias, I., et al.
(2012). Estudo e Conservação de Plantas Medicinais em Moçambique. Atas do
Congresso Internacional Saber Tropical em Moçambique: História, Memória e
Ciência (pp. 1-5). Lisboa: Instituto de Investigação Científica Tropical.
Taketa, A. T., Breitmaier, E., & Schenkel, E. P. (2004). Triterpenes and Triterpenoidal
Glycosides from the Fruits of Ilex paraguariensis (Mate). Journal of Brazilian
Chemical Society 2, 205-211.
Traoré, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. E., Ouédraogo, J. B., Pierre, G. I., Nacoulma, O.
G., et al. (2008). A New Oxygenated Ursane Derivative from Canthium multiflorum.
Planta Medica 74, 560–562.
Turner, Q. (2002). Medicinal Plants of Maputaland. In N. o. Network, & S. S. MÖSSMER
(Ed.), Computerisation of Southern African Herbaria (Vol. 7, pp. 114-115). Pretoria:
Sabonet News.
Yang, B., Chen, G., Chen, Z., Song, X., & Wang, J. (2010). Chimical Constituents and
Antimicrobial Activities of Canthium horridum. Natural Product Communications 5,
913-4.
Yang, C.-J., Wang, Z.-B., Zhu, D.-L., Yu, Y., Lei, Y.-T., & Liu, Y. (2012). Two New
Cyanogenic Glucosides from the Leaves of Hydrangea macrophylla. Molecules 17,
5396-5403.
Zhong, X.-N., Otsuka, H., Ide, T., Hirata, E., & Takeda, Y. (1999). Hydroquinone
Diglycoside Acyl Esters from Leaves of Myrsine seguinii. Phytochemistry 52 , 923927.
83
Amandio Zimba